109 高普考高考三級 生物技術 生物技術學 考古題詳解

核心觀念

本題評量分子生物學與生物技術核心的「基因功能缺失（Loss-of-Function, LOF）與蛋白質活性抑制技術」。命題重點在於區分**轉錄後基因沈默（Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS / RNA 干擾, RNAi）與轉譯後蛋白質活性阻斷（Post-Translational Inhibition）**兩大層次之分子工具：

1. RNA 干擾途徑（RNAi pathway）：小分子 RNA（siRNA、shRNA）透過 RNA 誘導沈默複合體（RISC）辨識互補 mRNA 並予以裂解或抑制轉譯，核心關鍵酵素為 Dicer（核酸內切酶）與 Argonaute 2（Ago2，RISC 催化核心）。
2. 抗體技術（Antibody-mediated inhibition）：利用免疫球蛋白之抗原結合區（Fab）專一性結合目標抗原蛋白質，藉由立體阻障（Steric hindrance）或構形改變阻斷其配體結合、酵素催化或二聚化反應。

解題方法

本題為標準的「三對象、三維度」申論題型。答題架構應採取「矩陣式對比」策略：

1. 橫向分述：依序針對「分子結構」、「抑制原理」與「實驗步驟流程」三個構面，分別論述 siRNA、shRNA 與抗體的確切機制，落實專有名詞（如 $3'$ 突出端、RISC、Dicer、Fab/Fc、轉染與轉導等）。
2. 縱向彙整：最後以「三者綜合比較表」總結作用層次、維持時效性（瞬時 vs. 穩定）、標靶位置（細胞質 vs. 胞外/膜蛋白）等關鍵差異，使評閱委員一目了然。

選項分析（申論命題構面剖析）

本題為高等考試申論題（非選擇題），針對題目指定之三種分子與三大維度進行逐項實質分析：

1. 短干擾 RNA（siRNA）：

• 分子結構：人工合成之雙股 RNA（dsRNA），長度通常為 21–23 個核苷酸（nt）。兩端具有特徵性的 2 個未配對核苷酸之 $3'$ 突出端（$2\text{-nt } 3'\text{ overhang}$），並帶有 $5'$ 磷酸基與 $3'$ 羥基。
• 抑制原理：作用於轉錄後層次（mRNA）。直接進入細胞質後，被載入 RISC（不需要細胞質 Dicer 切割，但需 TRBP/Ago2 協助）。雙股解旋後，引導股（guide strand）引導 RISC 與標靶 mRNA 互補結合，由 Ago2 酵素切斷 mRNA 導致其降解，專一性阻斷蛋白質轉譯。此抑制為瞬時性（transient，約維持 3–7 天）。
• 實驗流程：化學合成設計好的專一性 siRNA $\to$ 利用微脂體（Liposome）等轉染試劑進行瞬時轉染（transfection）入細胞 $\to$ 培養 24–72 小時 $\to$ 收集樣本以 RT-qPCR（mRNA 層次）與 Western blot（蛋白質層次）檢測抑制效率。

2. 短髮夾 RNA（shRNA）：

• 分子結構：由單股 RNA 自我回折形成的髮夾狀（hairpin）結構。包含長度約 19–29 個鹼基對的雙股莖部（stem，互補序列）、4–10 個核苷酸的短環（loop），以及轉錄終止產生的 $3'$ 端雙尿嘧啶（UU overhang）。其源於 DNA 載體在細胞核內轉錄表現。
• 抑制原理：作用於轉錄後層次（mRNA）。外源 DNA 質體或病毒載體進入細胞核，由 RNA 聚合酶（Pol III，如 U6 或 H1 promoter）轉錄出 shRNA 前驅物；經 Exportin-5 運出細胞核至細胞質；細胞質內的 Dicer 核酸酶辨識並剪除 loop 環部，加工生成成熟 siRNA，隨後組裝至 RISC 降解標靶 mRNA。若以反轉錄病毒或慢病毒整合入宿主染色體，可建立長期穩定敲低（Stable knockdown）。
• 實驗流程：設計互補寡核苷酸並選殖（cloning）至質體或慢病毒載體（lentiviral vector） $\to$ 質體轉染或以包裝細胞（如 HEK-293T）生產重組病毒顆粒 $\to$ 病毒轉導（transduction）感染目標細胞 $\to$ 加入抗生素（如 Puromycin）進行篩選 $\to$ 獲得穩定基因敲低細胞株，並以 RT-qPCR 與 Western blot 驗證。

3. 抗體（Antibody）：

• 分子結構：由四條多胜肽鏈（2 條重鏈 Heavy chain、2 條輕鏈 Light chain）藉由雙硫鍵連接而成的「Y」字型醣蛋白單體（約 150 kDa，以 IgG 為主）。結構分為抗原結合區（Fab 區，包含高度可變的 CDRs 決定專一性）與可結晶片段（Fc 區，媒介效應功能）。
• 抑制原理：作用於轉譯後蛋白質層次（Protein level）。抗體直接與成熟目標蛋白質（抗原）專一性結合。抑制機制包含：(1) 立體阻障直接封閉受體與配體之結合位點；(2) 遮蔽酵素活性中心；(3) 誘導受體胞吞作用（Internalization）並降解；(4) 在體內環境下透過 Fc 端活化補體（CDC）或媒介自然殺手細胞（ADCC）清除目標細胞。此法完全不改變 mRNA 表現量。
• 實驗流程：免疫動物或自噬菌體展示庫（Phage display library）篩選高親和力抗體 $\to$ 融合瘤技術（Hybridoma）或重組表現系統大量生產單株抗體（mAb） $\to$ 以 Protein A/G 親和層析管柱純化 $\to$ 將抗體直接投予細胞培養液（處理分泌性蛋白或膜表面受體）或經微注射導入胞內 $\to$ 經特定時間後以功能分析（如配體結合抑制、酵素活性測定、下游訊息傳遞磷酸化 Western blot）驗證活性阻斷效果。

解題技巧

1. 破題關鍵（層級定錨）：第一時間必須切分「核酸層次（siRNA、shRNA $\to$ 破壞 mRNA）」與「蛋白質層次（Antibody $\to$ 阻斷活性）」，這是閱卷給分的核心標準。
2. 加工酵素陷阱：許多考生常誤寫「siRNA 需被 Dicer 切割」。切記：外源化學合成之 21–23 bp siRNA 不需 Dicer 切割即可直接載入 RISC；而 shRNA 帶有 hairpin loop，必須經核內 Exportin-5 運出並由細胞質 Dicer 剪除 loop 才能成為具活性的 siRNA。
3. 實驗技術用語精確度：

• siRNA 導入細胞稱為轉染（Transfection）。

核心觀念

本題評量考生對「分子生物學中心法則」（Central Dogma：$\text{DNA} \rightarrow \text{RNA} \rightarrow \text{Protein}$）對應之高通量體學（Omics）定序技術的理解。考點聚焦於三種不同層次的技術：

1. 基因體層次（Genomics）：全基因體定序（WGS），測定生物體完整遺傳密碼（gDNA）。
2. 轉錄體層次（Transcriptomics）：RNA 定序（RNA-seq），測定特定時空環境下轉錄出的 RNA 種類與豐度。
3. 轉譯體層次（Translatomics）：核糖體足跡定序（Ribo-seq），測定正在被核糖體轉譯的 mRNA 片段，精準反映即時轉譯活性。

解題方法

本題為標準的比較型申論題。解題時應依循「中心法則」的脈絡，由上游至下游（DNA $\rightarrow$ 轉錄本 $\rightarrow$ 轉譯中 mRNA）依序論述，切入點包含：

1. 技術原理：明確寫出萃取標的分子、關鍵處理步驟（如剪切、逆轉錄、核酸酶保護消化）、建庫與定序原理。
2. 應用層面：列舉在疾病檢測、遺傳分析或功能研究上的具體指標。
3. 優缺點剖析：從解析度、覆蓋度、動態範圍、樣品要求及生物資訊門檻進行深度對比。
4. 統整對照：於最後列出綜合比較表，利於閱卷委員快速掌握關鍵字。

選項分析

本題為申論試題，非選擇題。作答時依題目要求拆解為三個獨立技術主題逐項剖析，得分關鍵與核心評分指標如下：

1. WGS（全基因體定序）：必須強調「不經選擇性捕捉，涵蓋非編碼區（non-coding regions）及調控區」，能偵測各類結構變異（SVs、CNVs），缺點在於成本高、資料量龐大且無法呈現動態表現量。
2. RNA-seq（RNA 定序）：必須強調「RNA 逆轉錄為 cDNA 後定序」，能偵測可變剪接（alternative splicing）與表現量差異，缺點為易受採樣時空背景限制、RNA 易降解且無法直接等同於蛋白質生成量。
3. Ribo-seq（核糖體足跡定序）：必須強調「利用核酸外切酶消化裸露 RNA，保留核糖體保護片段（Ribosome-Protected Fragments, RPFs）」，具備單密碼子（single-codon）解析度，缺點在於操作技術難度極高（需超高速離心與精確酵素控制）、起始細胞量需求大。

解題技巧

1. 中心法則定位法：作答開頭先點明三者分別位於 DNA、RNA 與 Protein 轉譯階段，架構層次立即顯現。
2. 關鍵字精準命中：

• WGS：gDNA、全覆蓋（coding + non-coding）、SNP/InDel/CNV/SV、De novo 組裝。
• RNA-seq：mRNA/total RNA、逆轉錄（RT）、cDNA 文庫、可變剪接、動態表現量。
• Ribo-seq：Cycloheximide（放線菌酮）、RNase I 消化、RPFs（約 28–30 nt）、轉譯效率（Translational efficiency）、單密碼子解析度。

3. 常見失分陷阱：

• 誤將 Ribo-seq 當作質譜儀蛋白質體學（Proteomics）；Ribo-seq 本質仍是高通量核酸定序技術。
• 描述 RNA-seq 時遺漏「逆轉錄成 cDNA」之關鍵建庫步驟。

【答案】

一、全基因體定序（Whole Genome Sequencing, WGS）

1. 技術原理：

• 樣品製備：自細胞或組織中純化高分子量基因體 DNA（gDNA）。
• 片段化與建庫：利用物理超音波剪切（sonication）或酵素法將 gDNA 隨機打斷為特定長度片段（通常約 300–500 bp），末端修補後於兩端接上特定接頭（adapters），建置定序文庫。
• 定序與分析：利用次世代定序（NGS）平台（如合成定序法，Sequencing by Synthesis）進行高通量雙端定序（paired-end sequencing）；定序所得 reads 與參考基因體（reference genome）比對或進行從頭組裝（de novo assembly）。

2. 應用與優點：

• 覆蓋全面：涵蓋蛋白質編碼區（exons）、內含子（introns）、啟動子、增強子及非編碼調控區，提供生物體最完整的遺傳圖譜。
• 多型性全面檢測：能精準鑑定單核苷酸多型性（SNPs）、小型插入/缺失（InDels）、拷貝數變異（CNVs）以及染色體結構變異（SVs，如倒位、易位）。
• 穩定性高：DNA 序列高度穩定，不受組織特異性、發育時期或外在環境刺激干擾。

3. 應用上的缺點：

• 成本與資料負擔：定序深度需求高（通常臨床診斷需 $30\times$ 以上），產生龐大的原始數據，對計算儲存與生物資訊分析資源要求極大。
• 無法反映動態表現：無法得知基因是否實際發生轉錄或轉譯，難以直接闡明細胞即時的生理活性與功能狀態。
• 重複序列比對困難：高度重複序列區（如端粒、著絲粒）在短讀長定序下易產生比對偏差或組裝斷裂。

核心觀念

本題聚焦於「新興傳染病之病毒學分子診斷與免疫檢驗技術」，為公職生物技術類科之重大時事與核心技術整合題。評量重點包含：

1. 臨床病毒檢體採集學：依據病毒複製部位與病程分期，選取合適之呼吸道檢體類別與採檢規範。
2. 分子診斷學（Molecular Diagnostics）：即時反轉錄聚合酶連鎖反應（Real-Time RT-PCR / RT-qPCR）的原理、TaqMan 螢光探針水解機制、擴增流程及閾值循環數（Cycle Threshold, $Ct$ 值）判定。
3. 免疫診斷學（Immunodiagnostics）：側向流體免疫層析法（Lateral Flow Immunoassay, LFIA）之雙抗體夾心呈色原理與操作步驟。
4. 檢驗醫學評估指標：診斷敏感度（Sensitivity）、特異性（Specificity）、檢驗時效（Turnaround Time, TAT）及偽陰性／偽陽性之臨床意涵。

解題方法

本題採申論結構化切入，答題架構如下：

1. 第 (一) 子題：採階層式分類陳述，區分為「上呼吸道檢體」、「下呼吸道檢體」及「輔助性檢體」，明確列舉臨床採檢名稱，凸顯採樣深度與病程嚴重度的關聯。
2. 第 (二) 子題：針對臨床最核心之兩大偵測策略——「核酸分子檢測（黃金標準）」 與 「抗原快速檢測（快篩）」，以清晰之對應條列或綜合架構，依序精準回答「反應原理」、「技術流程」與「優缺點比較」，符合評分規準中「原理明確、流程連貫、優缺點立體對比」之要求。

選項分析

本題為申論題，非選擇題。就答題時檢測方法的挑選分析如下：

• 分子核酸檢測（RT-qPCR）：必答主體。針對病毒基因組（單股正鏈 RNA），具最高靈敏度與特異度，為世界衛生組織（WHO）及衛生福利部疾病管制署（Taiwan CDC）認定之確診黃金標準。
• 抗原快篩（LFIA）：必答輔助對比。針對病毒結構蛋白（主要為 N 蛋白），操作便捷且時效性高，為大規模公衛篩檢的核心手段。
• 抗體檢測（Serology / ELISA / CLIA）：不宜作為回答現行感染檢測之主力。因人體感染後需數天至數週始產生特異性 IgM/IgG，無法及時阻斷早期急性傳播，僅適合回溯性流行病學調查或免疫力評估。

解題技巧

1. 採檢工具細節：採樣拭子須使用合成纖維（如 Dacron、Rayon 或植絨 Polyester）及塑膠柄，切忌使用含藻酸鈣（Calcium alginate）或木柄之棉花棒，因其殘留物會抑制 PCR 聚合酶活性。
2. 流程條列邏輯：描述分子生物流程務必遵循「採樣保存 $\rightarrow$ 病毒裂解與 RNA 萃取 $\rightarrow$ 試劑配置 $\rightarrow$ 反轉錄與擴增 $\rightarrow$ 訊號判讀」的標準操作程序（SOP）。
3. $Ct$ 值與病毒量關係：$Ct$ 值為螢光訊號跨越背景閥值時所需的循環數，與初始病毒核酸濃度之對數值成反比。公式為初始模板濃度比率約等於 $2^{-\Delta Ct}$（假設擴增效率為 100%），即 $Ct$ 值越低代表病毒量越高。

【答案】

(一) 檢測 SARS-CoV-2 感染應採取受檢者之檢體種類

檢體採集需視病程階段、病患臨床表徵（輕重症）及採檢環境決定，主要類別如下：

1. 上呼吸道檢體（Upper Respiratory Tract Specimens，最常規首選）

• 鼻咽拭子（Nasopharyngeal swab）：病毒載量最高，為早期感染診斷之標準首選檢體。
• 口咽拭子（Oropharyngeal swab）：常與鼻咽拭子合併採集以提高檢出率。
• 深喉唾液（Deep throat saliva）：受檢者自行咳出，降低醫護人員採檢暴露風險。

2. 下呼吸道檢體（Lower Respiratory Tract Specimens，重症或晚期患者）

• 痰液（Sputum）：適用於有深部咳嗽症狀之患者。
• 支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BALF） 或 氣管內抽取物（Tracheal aspirates）：適用於插管之重症肺炎患者，檢體檢出陽性率最高。

3. 其他輔助檢體

• 全血／血清（Serum/Plasma）：用於檢測宿主特異性抗體，評估感染後期免疫反應或流行病學回溯。

(二) 常用檢測方法之原理、檢測技術流程以及優缺點

臨床與公衛實務上最主要之檢測方法包含即時反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-qPCR）與抗原快速檢測（LFIA）：

核心觀念

本題評量重組蛋白質表現系統、蛋白質分子量推算，以及西方墨點法（Western blotting）之條帶判讀與生化修飾機制的整合應用：

1. 分子量估算公式與法則：

• 遺傳密碼三聯體法則：每 3 個鹼基（nucleotides/base pairs）構成一個密碼子（codon），轉譯為 1 個胺基酸（amino acid, a.a.）。
• 胺基酸平均分子量：單個游離胺基酸平均分子量約為 $128\ \mathrm{Da}$；在多胜肽鏈中，胺基酸經縮合聚合形成胜肽鍵時會脫去一分子水（$\mathrm{H_2O} \approx 18\ \mathrm{Da}$），因此多胜肽鏈中胺基酸殘基（amino acid residue）之平均分子量常以 $110\ \mathrm{Da}$（或考量胺基酸組成差異落於 $110 \sim 120\ \mathrm{Da}$）進行估算。

2. 西方墨點法與抗原抗體特異性：

• 西方墨點法係藉由專一性抗體 B 辨識蛋白質 A 上的特定抗原決定位（epitope）。
• 只要片段中保留該 epitope，無論是經轉譯後修飾、未完全加工、或部分水解降解之蛋白質片段，均能被抗體 B 結合而顯影。

3. 酵母菌宿主表現系統特性：

• 酵母菌（如 Saccharomyces cerevisiae 或 Pichia pastoris）為真核表現系統，具有內質網（ER）與高基氏體（Golgi apparatus），具備**轉譯後修飾（post-translational modifications, PTMs）**能力（特別是 N-linked 及 O-linked 醣基化修飾）與訊息胜肽切除加工機制。
• 酵母菌體內含有多種內源性蛋白酶（如液泡內蛋白酶 Pep4 等），在細胞破碎與純化過程中容易造成標的蛋白質之水解斷裂。

解題方法

(一) 蛋白質 A 分子量之估算

1. 推算胺基酸殘基數目：

• 題目給定 cDNA 長度為 $1.5\ \mathrm{kb} = 1500\ \mathrm{bp}$。
• 假設該 cDNA 全長皆為蛋白質編碼區（coding sequence, CDS / open reading frame, ORF）： $\text{密碼子數目} = \frac{1500\ \mathrm{bp}}{3\ \mathrm{bp/codon}} = 500\ \text{個密碼子}$
• 若扣除 1 個不轉譯為胺基酸的終止密碼子（stop codon），則轉譯出之多胜肽鏈含有 499 個胺基酸殘基；若不特別扣除終止密碼子，則概算為 500 個胺基酸殘基。

2. 計算蛋白質理論分子量：

• 以多胜肽鏈中胺基酸殘基的公認標準平均分子量 $110\ \mathrm{Da}$ 計算： $\text{分子量} = 500 \times 110\ \mathrm{Da} = 55,000\ \mathrm{Da} = 55\ \mathrm{kDa}$ （若以 499 個胺基酸計算：$499 \times 110\ \mathrm{Da} = 54,890\ \mathrm{Da} \approx 54.9\ \mathrm{kDa}$）。
• 若以胺基酸殘基常見經驗範圍 $110 \sim 120\ \mathrm{Da}$ 估計，分子量落於 $55 \sim 60\ \mathrm{kDa}$ 之間。國考閱卷標準通常以 $55\ \mathrm{kDa}$ 為基準答案。

(二) 西方墨點法額外條帶之可能原因分析

西方墨點法出現預期分子量條帶 C（約 $55\ \mathrm{kDa}$）之外的額外條帶，且皆能被專一性抗體 B 辨識，代表這些分子均保有蛋白質 A 的特定抗原決定位。以下分別說明原因：

1. 條帶 C 上方約 $+2\ \mathrm{kDa}$（分子量約 $57\ \mathrm{kDa}$）之可能原因

分子量增加約 $2\ \mathrm{kDa}$，代表蛋白質 A 發生了增加分子質量的修飾或前驅物未完全切割：

• 原因一：轉譯後之醣基化修飾（Post-translational Glycosylation）
• 酵母菌為真核宿主，具有內質網與高基氏體之醣基化路徑。人類蛋白質 A 若具有醣基化識別序列（例如 N-醣基化的 Asn-X-Ser/Thr 序列），於酵母菌中分泌表現時會被加上核心寡醣鏈（core oligosaccharides）。
• 一條典型的核心 N-聚醣結構質量約為 $1.5 \sim 2.5\ \mathrm{kDa}$。若蛋白質 A 部分分子發生了單一位置的醣基化修飾，即會形成遷移率較慢、分子量增加約 $+2\ \mathrm{kDa}$ 的額外條帶。
• 原因二：訊息胜肽（Signal Peptide）或融合標籤（Fusion Tag）未完全切除
• 基因重組工程中，常於 cDNA 上游構築分泌訊號胜肽（secretion signal sequence）或純化用融合標籤（如 FLAG tag, Myc tag, HA tag 或 His-tag 加上 linker 胜肽）。
• 短胜肽片段長度約為 $15 \sim 20$ 個胺基酸時，其分子量恰約為 $1.6 \sim 2.2\ \mathrm{kDa}$。

核心觀念

本題考查重組蛋白製備的完整流程：取得蛋白質 A 的編碼序列、將其接入表現載體、利用載體上的親和標籤純化蛋白質，以及判斷大腸桿菌表現系統造成蛋白質失活的原因。

載體圖中的 **MCS（multiple cloning site，多重選殖位點）**位於表現調控元件下游、TEV 切割位點與 C 端 His 標籤上游；圖示載體為 pEX-C-His，因此表現產物可帶有 C 端 His 標籤。

解題方法

依「取得正確基因 → 正確插入表現載體 → 利用標籤純化 → 檢查宿主是否能形成具功能的蛋白質」作答。每一步都要對應題目所問：完整編碼序列、載體插入位置與表現條件、純化原理與流程，以及原核表現造成失活的原因。

（一）選殖完整模板基因序列的重要步驟

1. 取得表現蛋白質 A 的細胞或組織，萃取總 RNA，並純化 mRNA。
2. 以反轉錄酶將 mRNA 反轉錄成互補 DNA（cDNA）。若目的是在大腸桿菌表現真核蛋白，使用 cDNA 可避免基因組 DNA 中的內含子無法在大腸桿菌中剪接的問題。
3. 依蛋白質 A 的序列設計引子，以 PCR 擴增涵蓋完整蛋白質編碼區的 DNA；確認擴增片段包含起始密碼子及完整開放閱讀框。
4. 將 PCR 產物純化、接入選殖載體並轉形宿主菌；以菌落 PCR、限制酶分析等方法篩選含有正確插入片段的菌落。
5. 對插入片段進行 DNA 定序，確認序列完整、方向正確且沒有 PCR 引入的突變。

（二）載體插入位置與大量表現的考量

所選殖的蛋白質 A 編碼序列應插入圖示的 MCS 區段，也就是位於 T7／LacO／RBS 下游、TEV 位點及 C 端 His 標籤上游的位置。可依插入基因序列中是否含有內部限制酶切位點，選用 MCS 中適合且唯一的限制酶位點進行方向性接合。

重組設計與表現時須考慮：

• 啟動子與宿主配合：T7 啟動子須由提供 T7 RNA 聚合酶的宿主菌株驅動，例如含有 T7 RNA 聚合酶系統的表現菌株；若採誘導式表現，須配合適當誘導條件。
• 方向與閱讀框正確：基因須依啟動子轉錄方向插入，並與 C 端 His 標籤保持正確閱讀框。
• 終止密碼子設計：若要表現與 C 端 His 標籤融合的蛋白質，蛋白質 A 編碼序列末端通常須移除終止密碼子，避免翻譯在 His 標籤之前停止。
• 限制酶位點適用：所選位點須能切開載體而不切斷目標基因；使用不同的兩個端點可提高插入方向正確的比例。
• 核糖體結合與密碼子使用：保留適當 RBS，並留意蛋白質 A 的密碼子是否適合大腸桿菌翻譯。
• 表現量與蛋白質品質：調整誘導強度及培養條件，避免過度表現造成細胞負擔、蛋白質聚集或形成不溶性包涵體。

（三）蛋白質 A 的純化技術

最適合此載體設計的是 固定化金屬離子親和層析（immobilized metal affinity chromatography, IMAC），常用 Ni-NTA 樹脂純化帶有 His 標籤的重組蛋白。

原理與材料