112 司法特考三等 鑑識人員 生物化學 考古題詳解

核心觀念

本題考查膠原蛋白的分子結構、特殊胺基酸組成，以及維生素 C 在膠原蛋白成熟過程中的作用。答題時，先說明膠原蛋白的三股螺旋與重複序列，再連結維生素 C 缺乏如何影響膠原蛋白交聯、結締組織強度及壞血病症狀。

解題方法

一、膠原蛋白的結構及胺基酸組成

膠原蛋白是結締組織的重要纖維蛋白，常見於皮膚、骨、軟骨、肌腱、韌帶及血管壁。其基本結構特色如下：

1. 三股螺旋結構：每條膠原多肽鏈（α 鏈）形成左手螺旋，三條 α 鏈再彼此纏繞，形成右手超螺旋的三股螺旋結構，稱為 tropocollagen。
2. 重複序列：胺基酸序列常以 Gly–X–Y 為重複單位，其中 X、Y 常為脯胺酸（proline）及其羥化產物羥脯胺酸（hydroxyproline）。
3. 甘胺酸含量高：每第三個位置幾乎都是甘胺酸（glycine）。甘胺酸側鏈只有一個氫原子，體積最小，能進入三股螺旋中央狹窄的空間，讓三條鏈緊密排列。
4. 脯胺酸與羥脯胺酸豐富：脯胺酸限制多肽鏈的構形，使鏈維持適合三股螺旋的形狀；羥脯胺酸有助於穩定三股螺旋，主要透過增加鏈間穩定作用。
5. 羥化與交聯：部分脯胺酸及離胺酸（lysine）殘基會在膠原成熟過程中被羥化，羥離胺酸也參與後續的分子間交聯。交聯使膠原纖維具有較高的抗拉強度。

二、維生素 C 缺乏造成壞血病的生化機轉

核心觀念

本題分成兩段：酵母菌將糖解作用產生的丙酮酸轉成乙醇，以及人體氧化乙醇的途徑與其造成肝損傷的代謝機制。作答時應交代各步驟的反應物、產物、酵素與輔因子，並說明乙醇代謝造成的氧化還原狀態改變如何影響肝細胞。

解題方法

沿著碳骨架追蹤反應即可：酵母菌先將丙酮酸脫羧成乙醛，再將乙醛還原成乙醇；人體則依序將乙醇氧化成乙醛、乙酸，最後轉為乙醯輔酶 A。每個氧化還原步驟同時標出輔酶的變化，便能連結到肝臟傷害機制。

一、酵母菌由丙酮酸產生乙醇

酵母菌在缺氧或氧氣不足時，進行酒精發酵，使糖解作用產生的丙酮酸轉為乙醇，並再生糖解作用所需的 $NAD^+$。

1. 丙酮酸脫羧：

$\text{丙酮酸} \longrightarrow \text{乙醛} + CO_2$

酵素為丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase）。此酵素需要焦磷酸硫胺素（TPP，來自維生素 $B_1$）及 $Mg^{2+}$。TPP 參與丙酮酸脫羧與反應中間體的穩定，$Mg^{2+}$ 有助於 TPP 與酵素結合及催化。

2. 乙醛還原成乙醇：

$\text{乙醛} + NADH + H^+ \longrightarrow \text{乙醇} + NAD^+$

酵素為酒精脫氫酶（alcohol dehydrogenase）。此反應以 $NADH$ 提供還原力，將乙醛還原成乙醇，並再生 $NAD^+$，供糖解作用中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶反應使用。酵母菌酒精脫氫酶通常含有鋅離子作為金屬輔因子。

兩步反應合併後，丙酮酸的羧基碳以 $CO_2$ 形式移除，其餘兩碳形成乙醇；糖解作用產生的 $NADH$ 則在發酵過程中氧化回 $NAD^+$。

二、人體乙醇的代謝途徑

1. 乙醇氧化成乙醛：

$\text{乙醇} + NAD^+ \longrightarrow \text{乙醛} + NADH + H^+$

主要由肝細胞細胞質中的酒精脫氫酶（ADH）催化，使用 $NAD^+$ 作為電子受體。飲酒量很大或長期大量飲酒時，平滑內質網中的微粒體乙醇氧化系統（MEOS）也會參與，主要酵素為 CYP2E1，以 $NADPH$ 和氧為反應所需物質。過氧化氫酶也能在過氧化氫存在下氧化乙醇，但一般情況下不是主要途徑。

2. 乙醛氧化成乙酸：

$\text{乙醛} + NAD^+ + H_2O \longrightarrow \text{乙酸} + NADH + H^+$

主要由粒線體中的乙醛脫氫酶（ALDH，尤以 ALDH2 為重要）催化，使用 $NAD^+$。乙醛具有反應性，若生成量超過肝臟清除能力，會在體內累積並造成細胞傷害。

3. 乙酸轉為乙醯輔酶 A：

核心觀念

真核生物的胰島素原基因含有內含子；大腸桿菌沒有剪接體，不能把轉錄本中的內含子剪除。因此，將人類基因組 DNA 直接放進大腸桿菌，通常不能得到正確的胰島素原蛋白。標準做法是先從胰臟 β 細胞取得已完成剪接的胰島素 mRNA，再以反轉錄酶製成不含內含子的互補 DNA（cDNA），將其接入大腸桿菌可辨識的表現載體。

另一個設計重點是區分「前胰島素原」（preproinsulin）與「胰島素原」（proinsulin）：前者含有 N 端訊號胜肽；人體細胞會將訊號胜肽切除，形成胰島素原。大腸桿菌不會依人體細胞的方式處理該訊號胜肽，因此應設計只編碼胰島素原的序列，或使用適當的融合蛋白與切割設計。

解題方法與實驗流程

1. 取得胰島素 mRNA 取人類胰臟 β 細胞，萃取總 RNA，再分離富含 poly(A) 尾端的 mRNA。胰島素 mRNA 已經過真核細胞的 RNA 剪接，保留可編碼蛋白質的外顯子序列。

2. 合成胰島素原 cDNA 以胰島素 mRNA 為模板，利用反轉錄酶合成第一股 cDNA；再合成第二股，取得雙股 cDNA。以 PCR 擴增胰島素原編碼區，並確認序列。若起始材料是完整前胰島素原 cDNA，須去除訊號胜肽的編碼區，或在表現設計中安排可正確切除的融合區段，使產物為胰島素原。

3. 建構大腸桿菌表現載體 將胰島素原 cDNA 接入表現載體的啟動子下游，使其具備大腸桿菌可辨識的核糖體結合位點、正確讀框與終止密碼子。載體須含有篩選標記，例如抗生素抗性基因。可直接表現胰島素原，也可讓其與載體中的融合蛋白相連，表現後再以特定方法切割釋出胰島素原。

4. 將重組載體導入大腸桿菌 以轉形方式將重組質體導入適合表現的菌株。塗布含有相應抗生素的培養基，挑選具有抗藥性、可能帶有質體的菌落。

5. 確認插入片段並誘導表現 以菌落 PCR、限制酶切分析或定序確認胰島素原 cDNA 已正確插入、方向與讀框正確。將陽性菌落培養至適當生長階段，再依載體設計誘導表現；

核心觀念與解題方法

本題考查五個生物化學名詞的定義、作用原理與生理意義。作答時，先精確界定名詞，再補充其關鍵成分、反應方向或操作原理，並指出常見用途或生理角色；不需列出與題意無關的細節。

（一）等電聚焦電泳（Isoelectric focusing electrophoresis, IEF）

等電聚焦是利用蛋白質或其他兩性分子在穩定 pH 梯度中的淨電荷差異進行分離的方法。施加電場後，分子會朝與其淨電荷相反的電極移動；當分子移至與自身等電點（isoelectric point, pI）相同的 pH 區域時，淨電荷為零，電泳遷移停止，因此聚焦在該位置。

不同蛋白質因 pI 不同而停留在不同位置，故可依 pI 分離。IEF 常用於蛋白質分析，也可與 SDS-PAGE 結合成二維電泳：第一維依 pI 分離，第二維依分子量分離。

**解題技巧：**抓住「pH 梯度」與「移至 pI 後淨電荷為零而聚焦」兩點，即可與單純依分子大小分離的電泳區別。

（二）全酶（Holoenzyme）

全酶是具有完整催化活性的酵素形式，由**蛋白質部分 apoenzyme（酶蛋白）與必要的非蛋白質輔因子（cofactor）**結合而成：

$$\text{Holoenzyme}=\text{Apoenzyme}+\text{必要輔因子}$$

輔因子可為金屬離子，也可為有機分子。有機輔因子若緊密或永久結合於酵素，常稱為輔基（prosthetic group）；若以較鬆散、可分離的方式參與反應，常稱為輔酶（coenzyme）。缺少必要輔因子的 apoenzyme 通常不具完整催化活性。

**解題技巧：**記憶「apoenzyme 是蛋白質部分；holoenzyme 是蛋白質加必要輔因子後的完整活性酵素」。

（三）卡爾文循環（Calvin cycle）

卡爾文循環又稱 Calvin–Benson cycle，是光合作用中固定二氧化碳並合成醣類前驅物的代謝循環，發生於葉綠體基質。它不直接利用光子，但所需的 ATP 與 NADPH 由光反應提供。

循環可分為三階段：

1. **碳固定：**酵素 RuBisCO 將 CO₂ 固定至核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP），形成不穩定的六碳中間物，隨即分解為 3-磷酸甘油酸（3-PGA）。
2. **還原：**3-PGA 使用 ATP 與 NADPH 還原，形成甘油醛-3-磷酸（G3P）。
3. **RuBP 再生：**部分 G3P 用於再生 RuBP，使循環得以持續；其餘 G3P 可作為合成醣類的碳源。

固定 3 個 CO₂，淨產生 1 個 G3P 約需消耗 9 個 ATP 與 6 個 NADPH；G3P 是三碳產物，後續可用於合成葡萄糖等碳水化合物。