114 高普考高考三級 食品衛生檢驗 食品分析與檢驗 考古題詳解

核心觀念

本題考的是液相層析串聯質譜（LC–MS/MS）或氣相層析串聯質譜（GC–MS/MS）定量時，如何降低或校正基質效應。食品中的脂質、色素、糖類、鹽類及其他共萃取物，可能影響分析物的離子化效率或儀器訊號，使分析物訊號增強或抑制，造成以純溶劑配製的檢量線無法準確反映樣品濃度。

基質效應常以訊號比較表示：

正值代表訊號增強，負值代表訊號抑制。以下四種方法的共同目的，是使校正訊號更能代表樣品中分析物的實際反應。

解題方法與四種校正方式

(1) 內部標準法（Internal standard）

在樣品、校正液及品管液中，加入固定量的內部標準品，再以分析物與內部標準品的訊號比值進行定量：

內部標準品宜具有與目標分析物相近的萃取、層析及離子化行為。同位素標記分析物（如氘代或 $^{13}\mathrm{C}$ 標記物）通常最適合，因其化學性質近似目標分析物，且質譜可分辨其訊號。

內部標準品若在萃取前加入，可補償樣品前處理中的損失及部分基質效應；若在萃取後才加入，主要補償進樣量差異及儀器訊號波動，無法校正先前的萃取損失。若內部標準品與分析物的基質反應不一致，或樣品與校正液的基質組成差異很大，校正效果會受限。

(2) 組織檢量線法（Tissue calibration curve）

以與待測樣品相同或相近的空白組織作為基質，加入不同濃度的分析物，並依待測樣品相同的前處理流程萃取、淨化及分析，建立檢量線。若要涵蓋前處理損失，分析物應在前處理前加入空白組織。

此法使標準品與樣品經歷相近的組織組成、萃取效率及基質效應，因此適用於動物組織等基質較明確的樣品。組織種類、脂肪含量或其他組成若與實際樣品差異明顯，校正仍可能不完全；也須取得適當空白組織。

（一）索氏萃取法測定食品脂肪含量

核心觀念

索氏萃取法利用脂質可溶於乙醚、石油醚等有機溶劑的性質，讓溶劑反覆蒸發、冷凝並流經樣品，使可被溶劑萃取的脂質溶入溶劑。萃取後蒸除溶劑，將燒瓶中留下的脂質乾燥至恆量，依重量增加量計算樣品的粗脂肪含量。

此法測得的是粗脂肪：除了三酸甘油酯，也可能包含其他能被該溶劑萃取的脂溶性物質。對含有與蛋白質或醣類結合脂質的食品，單純溶劑萃取可能無法完全釋出結合脂質。

操作步驟

1. 均質與稱樣：將樣品切碎、磨細或均質混勻，精確稱取適量樣品。食品須先適當乾燥；水分過多會妨礙有機溶劑萃取。
2. 裝入濾紙筒：將樣品置於圓筒濾紙內，以脫脂棉輕塞筒口，避免樣品逸出；濾紙筒應能放入索氏抽出管。
3. 準備接收燒瓶：在乾燥至恆量的燒瓶中放入沸石，記錄燒瓶與沸石重量 $W_0$。加入約半瓶容量的乙醚或石油醚。
4. 組裝與回流萃取：依序連接燒瓶、抽出管及冷凝管，於水浴加熱，使溶劑沸騰。溶劑蒸氣上升至冷凝管後凝結，滴入抽出管浸潤樣品；液面達虹吸管高度時，含脂質的溶劑流回燒瓶。持續回流萃取，直到脂質萃取完全。常用操作條件為約 $60\text{–}70^\circ\mathrm{C}$ 水浴萃取至少 8 小時；實際依採用的方法規定操作。
5. 回收溶劑：取出濾紙筒，繼續加熱回收燒瓶中的溶劑，避免將脂質一同帶走。
6. 乾燥、冷卻、稱重：將燒瓶置於烘箱乾燥，移入乾燥器冷卻後稱重；反覆乾燥、冷卻與稱重，至達恆量，記錄燒瓶、沸石及萃出脂質的總重量 $W$。

計算式為：

其中 $S$ 為樣品重量（g）；$W_0$ 為空燒瓶及沸石重量（g）；$W$ 為萃取後燒瓶、沸石及脂質的恆量重量（g）。

解題技巧與常見陷阱

核心觀念

魚貝類死亡後，肌肉細胞停止供氧與能量代謝，ATP 不再補充，原有 ATP 便在體內酵素作用下逐步分解。ATP 相關分解物的組成會隨死後時間改變，因此可用來評估魚肉鮮度。

本題重點有三項：說明 ATP 到次黃嘌呤的分解路徑、依 ATP 相關物質濃度計算 K 值，以及比較 K 值與 VBN、TMA 所反映的腐敗階段與測定目的。

（1）ATP 分解生成次黃嘌呤的過程

主要分解路徑如下：

各步驟說明如下：

1. ATPase 水解 ATP 的末端磷酸基，生成腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）。
2. 肌激酶（myokinase，又稱 adenylate kinase）催化二分子 ADP 進行磷酸基轉移，形成 ATP 與腺嘌呤核苷單磷酸（AMP）；之後 ATP 也會繼續被水解，因此 ADP 可轉為 AMP。
3. AMP 去胺酶（AMP deaminase）使 AMP 脫去胺基，形成肌苷酸（IMP）。
4. 5′-核苷酸酶水解 IMP 的磷酸基，生成肌苷（inosine，亦稱 HxR）。
5. 核苷磷酸化酶（nucleoside phosphorylase）使肌苷分解，生成次黃嘌呤（Hx）。

整體上，ATP 相關物質沿著腺嘌呤核苷酸、肌苷酸、肌苷到次黃嘌呤的方向分解；肌苷與次黃嘌呤增加，代表分解已進入較後段。

（2）由 ATP 相關分解物求得 K 值

先測定魚肉中 ATP、ADP、AMP、IMP、肌苷（HxR）及次黃嘌呤（Hx）的含量，再代入下式：

核心觀念

HPLC（高效能液相層析）是利用樣品成分在固定相與流動相之間作用力不同，造成在管柱中的滯留時間不同，進而分離各成分。成分與固定相作用愈強，通常滯留愈久；與流動相作用愈強，則較早流出。

胺基酸分析常見兩種搭配：

• 逆相 HPLC：先將胺基酸衍生化，使其具有紫外吸收或螢光訊號，再以 C18 管柱分離。
• 離子交換 HPLC：依胺基酸在不同 pH 下的電荷差異分離，再於管柱後衍生化，以茚三酮等試劑顯色或檢測。

（1）HPLC 分離食品中胺基酸的原理與操作步驟

分離原理

胺基酸同時具有胺基與羧基，會依流動相的 pH 改變帶電狀態及極性。若以離子交換管柱分析，胺基酸與帶相反電荷的固定相產生靜電作用；改變流動相的 pH 或離子強度，可使不同胺基酸依序自管柱洗脫。

若採用較常見的逆相方法，胺基酸本身通常缺乏足夠的紫外吸收或螢光訊號，且多具親水性，不利於直接以 C18 管柱分離，因此須先進行衍生化。衍生物在 C18 固定相與水相／有機相流動相間的疏水性不同，因而有不同滯留時間。常用衍生試劑包括 OPA、FMOC-Cl、PITC 等；OPA 適用於一級胺，脯胺酸等二級胺則須搭配 FMOC-Cl 等方法處理。

操作步驟

1. 樣品前處理 依分析目的取得游離胺基酸或總胺基酸。分析游離胺基酸時，可將食品均質、以適當溶劑萃取，再離心、過濾及稀釋。分析蛋白質組成時，通常須先水解蛋白質；一般酸水解會使色胺酸遭破壞，含硫胺基酸也可能需要另外處理，因此應依目標胺基酸選擇前處理條件。

2. 製備標準液與檢量線 配製已知濃度的胺基酸標準液，與樣品採相同衍生化及分析條件。以標準品的滯留時間協助鑑定，以峰面積或峰高建立檢量線並定量。

3. 衍生化 若使用逆相 HPLC，將樣品與標準液依方法加入衍生試劑反應。OPA 可與一級胺形成具螢光性的衍生物，但不適用於脯胺酸等二級胺；必要時以 FMOC-Cl 等試劑補足。若使用離子交換法，可先將胺基酸分離，再於管柱後與茚三酮反應檢測。

4. HPLC 分離 將流動相脫氣並平衡管柱，設定流速、溫度及等度或梯度洗脫條件，再注入樣品。逆相方法常以 C18 管柱搭配水相緩衝液與有機溶劑；離子交換法則以適當 pH 與離子強度的緩衝液控制洗脫。

5. 偵測與定量 依衍生物特性選用紫外光或螢光偵測器；茚三酮衍生法則依其顯色產物進行吸光偵測。比較樣品與標準品的滯留時間以鑑定，再由峰面積或峰高配合檢量線計算含量。

6. 結果與品質確認 檢查空白、標準品及重複樣品的分析結果，確認峰形、分離度與重現性。必要時以加標回收或內標法評估基質效應與分析準確度。

（2）各類 HPLC 管柱的分離原理、流動相與適用樣品