115 專利師高等考試 專利師(選試專業英文及生物技術) 生物技術 考古題詳解

核心觀念

本題考的是基因表現與蛋白質多樣性的關係。人體的蛋白質種類遠多於蛋白質編碼基因，主要原因是同一個基因可以透過不同層次的調控，產生多種蛋白質產物。

解題方法

可從「基因轉錄後的 RNA 處理」與「蛋白質形成後的加工」兩個階段說明：

1. 選擇性剪接（alternative splicing）：同一前驅 mRNA 的外顯子可用不同組合接合，形成不同成熟 mRNA，進而翻譯出結構或功能不同的蛋白質。
2. 不同轉錄起始與終止方式：同一基因可使用不同啟動子或轉錄終止位置，產生不同轉錄本。
3. RNA 編輯：轉錄後的 RNA 序列可經修飾而改變，使其編碼的蛋白質有所差異。
4. 蛋白質加工與修飾：同一多肽可經蛋白質水解、磷酸化、醣基化、乙醯化等處理，形成不同成熟形式或功能狀態。

核心觀念

「轉錄暫停」是指 RNA 聚合酶 II（Pol II）已在啟動子起始轉錄、合成一段短 RNA，卻暫時停留在基因轉錄起始點下游近端，尚未進入持續、有效率的延伸。此處所問主要是啟動子近端暫停（promoter-proximal pausing），不是轉錄終止，也不是 Pol II 尚未起始。

在許多真核生物基因中，Pol II 通過啟動子後約合成數十個核苷酸，即進入暫停狀態；常見位置約在轉錄起始點下游 +20 至 +60 個核苷酸。DSIF（DRB sensitivity-inducing factor）與 NELF（negative elongation factor）共同促成並穩定此狀態。後續若正向轉錄延伸因子 P-TEFb（positive transcription elongation factor b）被募集，便可促進 Pol II 解除暫停，轉入有效延伸。

解題方法

題目分成三個層次作答：先定義「暫停」是什麼，再說明 Pol II 為何在起始後停留於下游，最後列出暫停的調控與生物學功能。作答時應把「暫停的建立」和「暫停解除」連起來，才能說明這是基因表現調控的一個可控制步驟。

1. **建立暫停：**Pol II 起始後進入早期延伸階段；DSIF 與 NELF 作用，使 Pol II 在啟動子近端暫停。
2. **解除暫停：**細胞收到適當訊號後，P-TEFb 磷酸化 Pol II 的 C-terminal domain（CTD），並作用於 DSIF、NELF。NELF 從延伸複合體解離，DSIF 的作用轉為支持延伸，Pol II 因而進入有效率的轉錄延伸。
3. **連結功能：**這種「先停留、再依訊號釋放」的安排，使細胞能調節哪些基因開始大量轉錄、何時開始，以及起始後的 RNA 加工是否能與延伸銜接。

為何在下游暫停

核心觀念

本題考查 mRNA 技術如何從「依照固定抗原設計疫苗」，延伸為「依個別病人腫瘤特徵設計治療」。癌細胞累積的體細胞突變可能產生正常細胞沒有的蛋白質片段，稱為新抗原（neoantigen）。若新抗原能被病人的主要組織相容性複合體（MHC；人體稱 HLA）呈現，並被 T 細胞辨識，就可作為誘發抗腫瘤免疫反應的標的。

癌症 mRNA 疫苗屬於治療性疫苗：它提供編碼腫瘤抗原的 mRNA，使病人體內細胞表現抗原並啟動免疫反應，目的是辨識及清除癌細胞；作用方式不同於直接殺死腫瘤細胞的化學治療。

解題方法：由腫瘤檢體到免疫攻擊

可用「分析腫瘤、挑選新抗原、製作 mRNA、啟動 T 細胞、攻擊腫瘤」作答：

1. 取得腫瘤與正常組織資料 採集腫瘤組織，並以病人的正常細胞作為對照，進行次世代定序等分析。對照正常組織有助於區分腫瘤特有的體細胞突變與原本就存在的個體基因變異。也可分析 RNA，確認候選突變基因是否實際表現。

2. 預測並篩選個人化新抗原 確認病人的 HLA 型別，結合腫瘤突變及基因表現資料，預測哪些突變所產生的胜肽能被病人的 HLA 呈現。再依抗原表現、呈現能力及腫瘤特異性等條件篩選標的。由於同一病人的腫瘤可能同時有多種突變，疫苗可設計為涵蓋多個候選新抗原，提升免疫反應辨識腫瘤的機會。

3. 設計並製備 mRNA 疫苗 將選定抗原的編碼序列組合至 mRNA 設計中，經體外轉錄製備 mRNA，並以脂質奈米粒等載體包覆，以利遞送至細胞。疫苗進入體內後，mRNA 在細胞質中被翻譯成抗原蛋白；mRNA 本身不需進入細胞核，也不會因此整合進基因組。

核心觀念

本題考查細胞命運決定、誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）、部分細胞重新編程，以及表觀遺傳時鐘的意義。作答時須區分兩件事：山中因子是造成表觀遺傳重塑的轉錄因子；表觀遺傳鐘則是用來估算生物年齡的指標，不是修復組織的分子機器。

山中因子的定義

山中因子通常指四種轉錄因子：Oct3/4（Oct4）、Sox2、Klf4 與 c-Myc，合稱 OSKM。將這些因子導入已分化的體細胞並持續表現，可改變細胞的基因表現與表觀遺傳狀態，使細胞回到具有多能性的 iPSC 狀態。

其中，Oct4 與 Sox2 是多能性基因調控網路的核心因子；Klf4 參與維持細胞自我更新及調控基因表現；c-Myc 促進細胞增殖、代謝與染色質重塑，並提升重新編程效率。c-Myc 具有促癌特性，是完整 OSKM 應用的重要安全考量。

為何能讓細胞重新編程

已分化細胞雖與其他體細胞具有相同的基因組，卻因 DNA 甲基化、組蛋白修飾及染色質結構等調控，形成特定的基因表現模式，維持其細胞身分。OSKM 會啟動多能性相關基因網路、改變染色質可近性，並重塑 DNA 甲基化與組蛋白修飾；同時抑制原有分化狀態相關的調控程式。細胞因而逐步脫離原有命運，轉為多能性狀態。

重新編程的結果取決於因子表現的時間與強度：

• 完整、持續的重新編程：細胞可能喪失原有身分，成為 iPSC。
• 短暫或受控制的部分重新編程：細胞的部分老化相關表觀遺傳狀態被重設，並可保留原有體細胞身分。

後者是動物模式中研究組織年輕化的主要策略。控制表現時間十分重要；若重新編程過度，可能造成細胞去分化、組織結構受損或腫瘤形成。

表觀遺傳鐘與組織修復的關係

表觀遺傳鐘是依據 DNA 甲基化等表觀遺傳特徵建立的年齡估算工具。某些 CpG 位點的甲基化狀態會隨年齡呈現規律變化，將這些位點的資料帶入統計模型，可估算樣本的表觀遺傳年齡。其估值反映一組分子特徵，不等於細胞的實際修復能力，也不會自行使器官變年輕。

核心觀念

本題考查兩種 CRISPR 基因編輯策略的作用機制，以及精準基因編輯從實驗室走向大規模應用與臨床時的主要技術瓶頸。

傳統 CRISPR-Cas9 主要透過切斷 DNA 雙股，再由細胞修復系統完成基因破壞或序列改寫；鹼基編輯則在 Cas 蛋白定位後，直接化學轉換特定鹼基，通常不造成 DNA 雙股斷裂。兩者的差異核心在於：是否造成雙股斷裂，以及改寫 DNA 的方式。

解題方法

回答時先比較「分子組成與作用機制」，再比較「可達成的編輯結果與風險」，最後從臨床應用角度指出技術瓶頸。作答時須避免把鹼基編輯說成完全沒有副作用，也須將「編輯精準度」與「編輯工具能否送達目標細胞」分開說明。

一、傳統 CRISPR-Cas9

導引 RNA（guide RNA）帶領 Cas9 到達互補的目標 DNA 序列，Cas9 在目標位點造成 DNA 雙股斷裂（double-strand break, DSB）。細胞隨後以不同修復途徑修復：

• 非同源末端接合（NHEJ）：修復較快速，但常在斷裂處產生插入或缺失（indel），可用來使基因失活。
• 同源導向修復（HDR）：若提供模板，可依模板改寫序列；但效率會受細胞種類、細胞週期及修復能力影響。

因此，傳統 Cas9 適合基因敲除，也能配合修復模板進行較大幅度或指定序列的改寫，但雙股斷裂可能帶來較大的缺失、染色體重排或其他非預期修復結果。

二、鹼基編輯

鹼基編輯器通常由導引 RNA、Cas9 切口酶（nickase）或失去切割能力的 Cas9，以及鹼基脫胺酶組成。Cas 蛋白負責定位，脫胺酶則在 DNA 的特定編輯視窗內改變鹼基化學結構，經細胞修復或複製後形成指定鹼基配對。典型種類包括：

• 胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）：可將 $C \cdot G$ 鹼基對轉換為 $T \cdot A$。
• 腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）：可將 $A \cdot T$ 鹼基對轉換為 $G \cdot C$。

鹼基編輯通常不需要造成 DNA 雙股斷裂，也不需要 HDR 模板，因而適合處理特定的單鹼基變異。其限制包括可編輯的鹼基轉換類型有限、需要符合導引序列與 PAM 條件、編輯只發生在一定範圍的視窗內，以及視窗內其他同類鹼基可能一併被編輯，形成旁觀者編輯（bystander editing）。此外，仍須評估靶外編輯及 DNA 或 RNA 的非預期改變。

核心觀念

本題考查胰蛋白酶（trypsin）在貼附型細胞繼代培養中的作用，以及過度或過久使用時對細胞表面蛋白質的影響。胰蛋白酶是蛋白質水解酵素，會切割蛋白質中的特定胜肽鍵；它能分解細胞與培養皿、細胞彼此之間的黏附相關蛋白，使細胞脫附，方便分裝培養。

但細胞表面的受體、黏附分子及其他膜蛋白，其胞外部分也由蛋白質構成。胰蛋白酶作用過強或時間過長時，可能一併切割這些蛋白，使受體結構或數量受損，進而影響受體辨識配體、傳遞訊號及細胞對微環境的反應。

解題方法

解題時從「胰蛋白酶的作用對象」與「細胞受體的組成位置」切入：

1. 胰蛋白酶以蛋白質為作用基質，可水解細胞表面蛋白中的胜肽鍵。
2. 細胞表面受體通常是跨膜蛋白或醣蛋白，受體朝向細胞外的區域負責結合配體；細胞黏附分子也位於細胞表面。
3. 適度處理可讓細胞脫附；過度處理則可能切除受體的胞外區、改變受體構形，或使受體從細胞表面移除。
4. 受體受損後，即使細胞內的訊號傳遞元件仍存在，細胞也可能因無法有效接收外界訊號，而使下游訊號傳遞減弱或失常。

核心觀念

本題考查電穿孔細胞融合法如何利用電場，使細胞先緊密接觸，再促使相鄰細胞膜融合。關鍵是分清兩個階段：交流電場負責排列細胞；短暫高壓直流脈衝負責促成膜融合。

電穿孔細胞融合法（electrofusion）通常包含下列步驟：

1. **細胞排列與配對：**施加低強度、高頻交流電場，使細胞因介電泳作用移動並排列成串，讓相鄰細胞膜緊密接觸。
2. **誘發膜穿孔：**對已接觸的細胞施加短暫高強度直流脈衝，使接觸區細胞膜的跨膜電位達到穿孔閾值，形成暫時性膜孔。
3. **膜融合與修復：**接觸處相鄰細胞膜局部失穩、膜孔連通，形成融合通道；兩細胞的膜及細胞質因而連接，之後膜再重整，形成融合細胞。

因此，其核心物理機制可概括為：**電場誘發細胞定向接觸，並以電穿孔造成接觸區膜的局部破壞與重組，促成膜融合。**實際融合效果會受到細胞種類、接觸狀態、脈衝強度與時間等條件影響。

解題方法

題目要求比較電穿孔細胞融合法與化學 PEG 法，應從「如何讓細胞接觸」及「如何使膜融合」兩個層次作答。

PEG 法以聚乙二醇造成細胞膜表面脫水、促進細胞靠近與膜交互作用，進而增加融合機會；電穿孔細胞融合法則以電場控制細胞定位，再以電脈衝改變接觸區細胞膜的通透性與結構，促成膜融合。回答時要指出交流電場與直流脈衝分工不同，並說明此分階段控制為何有利於高價值單細胞融合。

核心觀念

本題考查美國最高法院在 Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc.（2013）案中，如何區分天然 DNA 與人工製成的互補 DNA（cDNA），並適用美國專利法第 101 條的可專利標的規定。

依美國專利法第 101 條，發明人得就新的且有用的製程、機器、製品或物質組成申請專利。但司法判例排除自然法則、自然現象及自然產物本身；即使某種天然物質是首次被發現，或經由人為分離，也不當然成為可專利標的。

DNA 中，**外顯子（exons）**是會保留在成熟 mRNA、並參與蛋白質編碼的區段；**內含子（introns）**則在 RNA 加工時被剪除。cDNA 是以成熟 mRNA 為模板製成的 DNA，通常不含內含子。

解題方法與判決標準

解題時應依序判斷：主張的 DNA 是否天然存在、分離或製造是否改變其核苷酸序列，以及該 DNA 是否因人為製作而具有與天然物實質不同的結構特徵。

一、天然 DNA：單純分離不足以取得適格性

Myriad 找出 BRCA1、BRCA2 基因在染色體上的位置與序列，並主張其分離出的 DNA 具有專利適格性。最高法院認為，天然 DNA 的核苷酸序列是自然界既存的資訊。將基因從染色體中切下、分離，雖會切斷其與周邊 DNA 的化學鍵結，但如果所主張的 DNA 序列仍與天然基因相同，這種分離本身不足以使其脫離「自然產物」的範疇。

因此，天然 DNA 片段不會僅因被發現、定位或分離，就成為可專利標的。法院特別指出，這類主張可能不當壟斷基礎遺傳資訊，以及研究與使用天然基因的空間。

二、cDNA：通常具有適格性，但須注意例外

cDNA 由成熟 mRNA 反轉錄而來，通常省略天然基因中的內含子，形成與天然染色體 DNA 不同的核苷酸結構。最高法院因此認定，這類人工製成、在自然界通常不存在的 cDNA，原則上屬於第 101 條的可專利標的。