核心觀念

本題考查 DNA 損傷修復、非編碼 RNA、核酸定量技術、基因體變異分析、轉位元件、RNA 剪接，以及蛋白質進入內膜系統的轉運機制。作答時宜先界定名詞，再交代作用機制與生物學意義；比較容易混淆的技術或機制，則補上關鍵差異。

（一）鹼基切除修復（base excision repair, BER）

核心觀念： BER 是修復小型、非造成 DNA 雙股螺旋明顯扭曲之鹼基損傷的主要途徑，例如氧化、去胺基、烷基化或自發性去嘌呤／去嘧啶所造成的損傷。

解題方法與機制： 修復從辨識受損鹼基開始，依序進行：

1. DNA 糖基酶辨認受損鹼基，切斷鹼基與去氧核糖間的 N-糖苷鍵，留下無鹼基位點（AP site）。
2. AP 內切酶切開 AP site 附近的 DNA 磷酸二酯骨架。
3. DNA 磷酸二酯酶／去氧核糖磷酸酶移除殘留的糖磷酸基；DNA 聚合酶依未受損股作為模板，填入正確核苷酸。
4. DNA 連接酶封合缺口，恢復 DNA 骨架。

BER 可採短片段或長片段修復；兩者填補的核苷酸數目與參與的酵素略有不同，但共同目標都是移除受損鹼基並恢復正確序列。

解題技巧： 記住「糖基酶先除鹼基、AP 內切酶再切骨架」，即可與核苷酸切除修復（NER）區分。NER 通常處理較大、會扭曲 DNA 雙股螺旋的損傷。

（二）長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding RNA, lncRNA）

核心觀念： lncRNA 是長度通常大於 200 個核苷酸、但不具典型蛋白質編碼能力的 RNA。它可由 RNA 聚合酶轉錄，部分 lncRNA 具有加帽、剪接及多聚腺苷酸尾等類似 mRNA 的加工特徵。

解題方法與功能： 依作用方式，lncRNA 可在細胞核或細胞質中調控基因表現，常見功能包括：

• 引導（guide）： 將染色質修飾複合體帶到特定基因座，影響染色質狀態與轉錄。
• 支架（scaffold）： 提供多種蛋白質聚集的平台，協助形成調控複合體。
• 誘餌（decoy）： 結合轉錄因子、RNA 結合蛋白或微小 RNA，改變其可利用性。
• 調控轉錄後作用： 影響 RNA 剪接、穩定性、運輸或翻譯。

解題技巧： 「非編碼」意指不以產生典型蛋白質為主要功能，不代表沒有功能；作答時寫出長度界定及至少一項調控機制，較能呈現完整概念。

（三）數字 PCR（digital PCR, dPCR）

核心觀念： dPCR 是將含有核酸樣本的 PCR 反應分割成大量微小反應單元，分別判定各單元為陽性或陰性，再以陽性比例估算起始目標分子的絕對數量。與依標準曲線推估濃度的定量 PCR（qPCR）相比，dPCR 可進行不依賴標準曲線的絕對定量。

解題方法與原理：

1. 將樣本分配到許多微滴、微孔或晶片反應區。
2. 進行 PCR，逐一判定每個單元是否有目標序列擴增。
3. 計算陽性單元比例，並以卜瓦松分布校正每個單元可能同時含有多個目標分子的情形。若陽性比例為 $p$，平均每個反應單元的目標分子數為 $\lambda=-\ln(1-p).$
4. 以 $\lambda$ 乘以反應單元數，再依樣本體積換算目標分子的總數或濃度。

dPCR 常用於低頻突變、拷貝數變異、病原體核酸或微量核酸的高精度定量。

解題技巧： 關鍵詞是「分隔、陽性／陰性判讀、卜瓦松校正、絕對定量」。若只寫「PCR 放大 DNA」，未說明分隔與定量原理，便沒有點出 dPCR 的特徵。

（四）比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）

核心觀念： CGH 是比較檢體與參考基因組 DNA 之間拷貝數差異的技術，可用於偵測染色體片段的增益或缺失。傳統 CGH 將兩者標記不同螢光染料後，競爭性雜交至正常中期染色體；

核心觀念

點突變（point mutation）是 DNA 序列中單一核苷酸發生替換、插入或缺失；本題主要以單一鹼基替換為例，說明如何辨認正常型與突變型等位基因。常見檢測策略可分為兩類：利用已知序列差異做「等位基因辨識」，或直接讀取目標區域的 DNA 序列。

以下列出三種方法：等位基因特異性 PCR（ARMS-PCR）、PCR-RFLP、Sanger 定序。前兩者適合檢測已知突變；Sanger 定序可讀出目標區域的核苷酸序列，確認變異位置與種類。

解題方法與實驗原理

一、等位基因特異性 PCR（ARMS-PCR）

原理： PCR 引子與模板的互補程度會影響延伸效率。將等位基因特異性引子的 3′ 端設計在突變位置，使其與突變型序列完全配對；若模板是正常型，則 3′ 端形成錯配，聚合酶不易延伸。透過是否產生預期 PCR 產物，判定樣本是否帶有特定等位基因。ARMS 為常用的等位基因特異性擴增方法。

主要步驟：

1. 萃取樣本 DNA，確認待測突變位置及正常型、突變型序列。
2. 設計突變型與正常型各自的等位基因特異性引子，並配合共同引子；引子 3′ 端對準變異鹼基。
3. 分別進行 PCR，並設置已知正常型、突變型及陰性對照。
4. 以凝膠電泳或即時 PCR 訊號判讀是否出現特異性產物。
5. 僅正常型反應陽性表示檢出正常型；僅突變型反應陽性表示檢出突變型；兩者皆陽性表示樣本含兩種等位基因，常見於雜合子。需以對照確認反應有效。

二、PCR-RFLP（聚合酶連鎖反應－限制片段長度多型性分析）

原理： 限制酶辨認特定 DNA 序列並在該處切割。若點突變造成辨認序列形成或消失，正常型與突變型的 PCR 產物經限制酶消化後會形成不同長度的片段，再以電泳分離判讀。若突變本身不影響限制酶辨認位點，可在引子中設計錯配，使 PCR 產物的限制酶切位點依等位基因而形成或消失。

主要步驟：

1. 設計引子，PCR 擴增涵蓋突變位置的 DNA 片段。
2. 選用可區分正常型與突變型的限制酶；先確認突變是否改變辨認位點，必要時以引子錯配建立可辨識位點。
3. 將 PCR 產物與限制酶及適當反應液孵育消化。
4. 以瓊脂糖凝膠電泳分離消化產物，依片段大小及條帶型態判定基因型。
5. 未切割片段與切割片段型態依設計而定；雜合樣本通常同時呈現正常型與突變型對應的條帶。

三、Sanger 鏈終止定序

核心觀念

甲基化 PCR 通常指甲基化特異性 PCR（methylation-specific PCR, MSP）。此法利用 DNA 甲基化與未甲基化胞嘧啶在亞硫酸氫鈉處理後的差異，設計兩組具序列選擇性的引子，以檢測特定基因區域的 CpG 位點是否甲基化。

亞硫酸氫鈉處理後：

• **未甲基化的胞嘧啶（C）**轉變為尿嘧啶（U），PCR 擴增時以胸腺嘧啶（T）呈現。
• 甲基化的胞嘧啶受到保護，仍以 C 呈現。

因此，原本序列相同的 DNA 會因甲基化狀態不同而產生序列差異。MSP 依此設計兩組引子：

• M 引子：配合甲基化 DNA 轉換後仍保留 C 的序列。
• U 引子：配合未甲基化 DNA 中 C 轉為 T 的序列。

解題方法與主要實驗步驟

本題應依序說明「化學轉換造成序列差異、引子辨認差異、PCR 產物判定甲基化狀態」。

1. 取得待測 DNA 從細胞或組織樣本抽取基因組 DNA，並確認 DNA 品質適合後續處理。

2. 亞硫酸氫鈉轉換 將 DNA 以亞硫酸氫鈉處理，使未甲基化的 C 轉為 U；甲基化的 C 則保留為 C。處理後進行純化，取得轉換後 DNA 作為 PCR 模板。

3. 設計兩組引子 針對待測區域設計甲基化引子 M 與未甲基化引子 U。引子應涵蓋關鍵 CpG 位點，使 M、U 引子分別能辨認各自對應的轉換後序列。

4. 分別進行 PCR 將同一份轉換後 DNA 分別與 M 引子組、U 引子組進行 PCR。通常以凝膠電泳檢視是否出現預期大小的擴增產物。

5. 設置必要對照 甲基化與未甲基化 DNA 對照可確認引子及轉換反應有效；無模板對照可排除污染；未處理 DNA 或其他適當的轉換效率對照，可協助評估轉換是否完整。

核心觀念

染色質重塑（chromatin remodeling）是指細胞藉由改變染色質的結構、核小體的位置或組成，調節 DNA 的可近性，進而影響轉錄、DNA 複製、修復與重組等作用。真核細胞的 DNA 緊密包裹於核小體中；每個核小體由約 147 個鹼基對的 DNA 繞在組蛋白八聚體外形成。這種包裝有助於收納 DNA，也會遮蔽轉錄因子與其他 DNA 結合蛋白的作用位點。

廣義的染色質重塑包括兩類主要形式：

1. 組蛋白共價修飾：改變組蛋白尾端的化學修飾，影響核小體穩定性或招募特定蛋白。
2. ATP 依賴性核小體重塑：利用 ATP 水解能量，移動、移除或改變核小體的組成。

兩者可彼此協同：組蛋白修飾能招募重塑複合體，重塑複合體則重新安排核小體，改變 DNA 的可近性。

解題方法

作答時依序交代「重塑的定義與目的」、「重塑的形式」、「各形式的機轉」及「主要蛋白因子」。尤其須區分組蛋白修飾酵素與 ATP 依賴性重塑複合體：前者改變組蛋白的化學標記，後者直接改變核小體的位置、穩定性或組成。

一、組蛋白共價修飾

組蛋白尾端可接受多種可逆的化學修飾，包括乙醯化、甲基化、磷酸化及泛素化等。這些修飾可改變組蛋白與 DNA 的作用，也能形成特定蛋白的辨識標記，進而促進或抑制基因表現。

• 乙醯化：組蛋白乙醯轉移酶（histone acetyltransferase, HAT）將乙醯基加到組蛋白尾端的離胺酸，降低其正電荷與帶負電的 DNA 間的吸引力，通常使染色質較開放，利於轉錄。組蛋白去乙醯酶（histone deacetylase, HDAC）移除乙醯基，常使染色質趨於緊密。
• 甲基化：組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferase）與去甲基酶（histone demethylase）分別添加或移除甲基。甲基化的作用依修飾位置及程度而異，例如 H3K4 甲基化常與轉錄活化相關，H3K9 或 H3K27 甲基化常與轉錄抑制相關。
• 其他修飾：磷酸化、泛素化等也可改變染色質狀態，或招募辨識特定修飾的蛋白。

二、ATP 依賴性核小體重塑

此類重塑複合體含有 ATPase／DNA translocase 催化次單元。

核心觀念

本題考查粒線體 DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）的基因體組織、遺傳特徵，以及它與細胞核染色體基因體的比較。作答時可先交代 mtDNA 的基本結構與編碼內容，再從遺傳方式、基因排列、基因表現及複製特性比較兩者。

人類 mtDNA 是位於粒線體內的環狀雙股 DNA，長約 16,569 個鹼基對。它主要編碼粒線體氧化磷酸化系統所需的部分成分；粒線體其餘大量蛋白質則由核基因編碼，再運送進粒線體。

解題方法

採用「基因體特徵」與「相對於核染色體的差異」兩部分作答，並用遺傳、結構、基因內容與表現方式逐項比較。

一、粒線體基因體的主要特徵

1. 環狀、雙股且基因密集 人類 mtDNA 為環狀雙股分子，基因排列緊密，非編碼區比例低；主要非編碼區稱為控制區或 D-loop，包含與複製、轉錄調控相關的序列。

2. 具有兩條不同的 DNA 鏈 依鹼基組成與密度差異，稱為重鏈（heavy strand, H strand）與輕鏈（light strand, L strand）。人類 mtDNA 共編碼 37 個基因：13 個蛋白質、22 個轉運 RNA（tRNA）及 2 個核糖體 RNA（rRNA）。其中 28 個基因位於 H 鏈，9 個位於 L 鏈。

3. 蛋白質編碼集中於氧化磷酸化系統 13 個蛋白質基因皆與電子傳遞鏈及 ATP 合成相關。粒線體本身具有轉譯所需的部分 RNA 與核糖體，但其蛋白質合成能力有限，不能獨立製造所有粒線體蛋白質。

4. 多拷貝與異質性 一個細胞含有許多粒線體，而每個粒線體通常也含有多個 mtDNA 分子，因此單一細胞可有多份 mtDNA。若同一細胞內同時存在正常型與突變型 mtDNA，稱為異質性（heteroplasmy）；若僅有一種型態，則稱為同質性（homoplasmy）。

5. 母系遺傳為典型遺傳方式 人類 mtDNA 通常由母親傳給子代，父系貢獻通常極少或不具遺傳意義。異質性比例在細胞分裂與生殖細胞形成時可能改變，因而造成同一家族成員間症狀或變異比例不同。