110 調查局特考三等 醫學鑑識組 分子生物學 考古題詳解

核心觀念

本題考查兩類拓撲異構酶（topoisomerase）如何改變 DNA 的拓撲狀態，以及共價閉合環狀 DNA 經不同處理後，在瓊脂糖膠體電泳中的遷移差異。

DNA 拓撲異構酶的共同功能，是暫時切斷 DNA 磷酸二酯鍵，使 DNA 鏈段能夠旋轉或彼此穿越，再將斷口重新接合，藉此改變連結數（linking number, $Lk$）、扭轉數（twist, $Tw$）與纏繞數（writhe, $Wr$）：

$$Lk=Tw+Wr$$

對於共價閉合環狀 DNA，$Lk$ 為拓撲性質，必須先切斷 DNA 鏈才能改變。DNA 超螺旋可分為負超螺旋與正超螺旋；細胞必須藉由拓撲異構酶調節超螺旋，才能順利進行複製、轉錄、重組及染色體分離。

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第一型拓撲異構酶（Type I topoisomerase）

作用機制

第一型拓撲異構酶每次只切斷一條 DNA 鏈，因此形成暫時性單股斷裂（single-strand break）。

酵素的活性位點酪胺酸（Tyr）與 DNA 磷酸基形成暫時性的共價磷酸酪胺酸鍵，使斷裂的 DNA 末端仍與酵素相連，避免 DNA 片段散失。接著藉由 DNA 鏈的旋轉或單股 DNA 穿越，消除超螺旋，最後由同一酵素催化重新接合 DNA。

典型反應可概括為：

$$\text{DNA 切開} \rightarrow \text{DNA 鏈旋轉或穿越} \rightarrow \text{DNA 重新接合}$$

第一型拓撲異構酶通常每次使 $Lk$ 改變 $1$。

Type IA 與 Type IB

第一型拓撲異構酶可細分為 Type IA 與 Type IB。

Type IA

Type IA 通常先形成單股斷裂，使未斷裂的另一股 DNA 穿越斷口，再重新連接。此類酵素常需要二價金屬離子協助，許多細菌型 Type IA 拓撲異構酶主要負責消除負超螺旋。

Type IB

Type IB 形成單股斷裂後，允許 DNA 端部相對於另一部分自由旋轉，藉由旋轉釋放 DNA 的扭轉張力，再將 DNA 接回。真核細胞的 DNA topoisomerase I 屬於此類，通常可鬆弛正、負超螺旋，且一般不需要 ATP。

細胞內參與的反應

第一型拓撲異構酶參與：

1. DNA 複製：消除複製叉前方累積的扭轉張力，協助複製叉前進。
2. DNA 轉錄：RNA polymerase 前方常形成正超螺旋，後方形成負超螺旋，拓撲異構酶可降低此種轉錄所造成的張力。
3. DNA 重組與修復：協助 DNA 鏈段改變拓撲關係。
4. 解除負超螺旋與維持染色體拓撲平衡：使 DNA 維持適合細胞功能的超螺旋程度。
5. 解除互相纏繞的單股區域：部分 Type IA 酵素可協助處理複製或重組過程中的 DNA 結構。

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第二型拓撲異構酶（Type II topoisomerase）

作用機制

第二型拓撲異構酶一次切斷 DNA 的兩條鏈，形成暫時性雙股斷裂（double-strand break），再讓另一段完整的雙股 DNA 穿越此斷口，最後將原先的雙股斷裂重新接合。

其反應流程為：

$$\text{雙股 DNA 切開} \rightarrow \text{另一段雙股 DNA 穿越} \rightarrow \text{雙股 DNA 重新接合}$$

第二型拓撲異構酶每完成一次反應，通常使 $Lk$ 改變 $2$。此反應需要 ATP 提供能量，因為酵素必須進行構形變化，以捕捉、轉移並釋放 DNA 雙股區段。

第二型拓撲異構酶具有兩個重要 DNA 結合區域：

• G segment：被酵素暫時切開的 DNA 區段。
• T segment：穿越 G segment 斷口的另一段 DNA。

其基本機制可表示為：

$$T\text{ segment} \text{ 穿越暫時切開的 } G\text{ segment}$$

細胞內參與的反應

第二型拓撲異構酶參與：

1. DNA 複製後子代染色體的去連環化（decatenation）：將彼此套住的子代 DNA 分開。
2. 解除複製叉前方的正超螺旋：避免複製過程中 DNA 過度扭轉。
3. 染色體凝縮與分離：協助染色體形成適當拓撲結構，並在有絲分裂或減數分裂時完成分離。
4. DNA 修復與重組：使 DNA 雙股區段彼此穿越，改變染色體拓撲排列。
5. 轉錄相關拓撲調節：消除 RNA polymerase 活動造成的 DNA 拓撲壓力。
6. 細菌 DNA 超螺旋調控：細菌 DNA gyrase 可利用 ATP 將負超螺旋導入 DNA，同時也能解除正超螺旋；細菌 topoisomerase IV 則特別重要於複製後染色體去連環化。

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Type I 與 Type II 的比較

比較項目	Type I	Type II
每次切斷的 DNA 鏈數	一條	兩條
是否形成暫時性雙股斷裂	否	是
DNA 區段穿越方式	單股穿越或 DNA 端旋轉	一段雙股 DNA 穿越另一段雙股 DNA
$Lk$ 改變量	通常為 $1$	通常為 $2$
ATP	多數不需要	需要
主要功能	鬆弛超螺旋、解除扭轉張力	去連環化、染色體分離、調整雙股 DNA 拓撲
代表性反應	DNA 鏈旋轉、單股穿越	G segment 切開，T segment 穿越

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解題方法：判斷三種 DNA 電泳型態

題目給的是全長 $10\text{ kb}$ 的共價閉合環狀 DNA。判斷電泳圖型時，先確認三個關鍵：

核心觀念

本題核心在於掌握三個層次：

1. 核小體核心顆粒的結構與組成。
2. 組織蛋白的轉譯後修飾（post-translational modifications, PTMs）。
3. 這些修飾如何改變染色質結構、招募調控蛋白，進而影響基因表現及其他細胞生物學過程。

核小體（nucleosome）是染色質的基本結構單位，由組織蛋白八聚體與其外圍纏繞的 DNA 所形成。每一個核小體核心顆粒約包覆 $147$ 個鹼基對 DNA，DNA 約繞組織蛋白八聚體 $1.65$ 圈。

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解題方法

作答時可依照「結構 → 修飾種類 → 基因調控機制 → 其他生物功能」的順序：

• 第一小題寫出核心組蛋白八聚體。
• 第二小題分類列出主要組織蛋白轉譯後修飾。
• 第三小題說明修飾如何透過染色質鬆緊、電荷改變及蛋白質招募調控轉錄。
• 第四小題補充 DNA 修復、複製、重組、染色體分離等功能。

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（一）核小體核心顆粒的蛋白組成

核小體核心顆粒由組織蛋白八聚體（histone octamer）與纏繞其外的 DNA 組成。

組織蛋白八聚體包含四種核心組織蛋白，每種各有兩個：

$$2 \times H2A + 2 \times H2B + 2 \times H3 + 2 \times H4$$

其排列方式為：

• 中央為一個 $H3-H4$ 四聚體，即 $H3_2H4_2$。
• 兩側各配置一個 $H2A-H2B$ 二聚體，即兩個 $H2A_2H2B_2$ 單位。
• 合計形成 $H2A_2H2B_2H3_2H4_2$ 的八聚體。

約 $147$ 個鹼基對 DNA 環繞此八聚體，形成核小體核心顆粒。$H1$ 組織蛋白位於 linker DNA 附近，協助穩定高階染色質結構，但不屬於核小體核心八聚體。

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（二）組織蛋白的轉譯後修飾

組織蛋白修飾主要發生在其 N 端尾端（histone tails），也可發生於球狀結構區域。主要種類如下：

1. 乙醯化（acetylation）

常見於 $H3$、$H4$ 的離胺酸（lysine, K）殘基，例如：

• $H3K27ac$
• $H3K9ac$
• $H4K16ac$

乙醯化通常由 histone acetyltransferase（HAT）催化，並由 histone deacetylase（HDAC）移除。

2. 甲基化（methylation）

可發生於離胺酸或精胺酸（arginine, R）殘基。離胺酸甲基化可分為單甲基、雙甲基及三甲基：

• $H3K4me3$：常與活化轉錄的啟動子相關。
• $H3K27me3$：常與 Polycomb 介導的抑制相關。
• $H3K9me3$：常見於異染色質及轉錄抑制。
• $H3K36me3$：常與轉錄延伸相關。

甲基化不一定代表活化或抑制，必須視修飾位置及甲基化程度而定。

3. 磷酸化（phosphorylation）

常發生於絲胺酸（serine, S）、蘇胺酸（threonine, T）或酪胺酸（tyrosine, Y）殘基，例如：

• $H3S10ph$
• $H2AXS139ph$，又稱 $\gamma H2AX$

磷酸化由 kinase 加入磷酸基，並由 phosphatase 移除。

4. 泛素化（ubiquitination）

組織蛋白可接受單泛素或多泛素修飾，例如：

• $H2AK119ub$：常與轉錄抑制相關。
• $H2BK120ub$：可促進某些轉錄相關甲基化，與轉錄活化及延伸有關。

組織蛋白泛素化通常不是直接將組織蛋白送往蛋白酶體分解，而是作為染色質調控訊號。

5. SUMO 化（SUMOylation）

將 SUMO（small ubiquitin-like modifier）接到組織蛋白上，通常與轉錄抑制、染色質緊密化及基因組穩定性有關。

6. ADP-核糖化（ADP-ribosylation）

可發生於 DNA 損傷反應，協助招募修復因子並調節染色質狀態。

7. 瓜胺酸化（citrullination）

由 peptidylarginine deiminase（PAD）將精胺酸轉換為瓜胺酸，會影響組織蛋白與 DNA 的結合，並參與染色質去凝聚及特定細胞分化過程。

8. 其他修飾

組織蛋白亦可發生：

• 巴豆醯化（crotonylation）
• 丙醯化（propionylation）
• 丁醯化（butyrylation）
• O-GlcNAc 修飾
• 脂質化等

其中巴豆醯化常與活化轉錄及特定細胞命運調控有關。

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（三）轉譯後修飾如何調控基因表現

1. 改變組織蛋白與 DNA 的靜電作用

DNA 帶負電，組織蛋白中的離胺酸與精胺酸帶正電，因此能夠與 DNA 緊密結合。

離胺酸乙醯化會中和其正電荷，使組織蛋白與 DNA 的吸引力下降，核小體較容易鬆開，轉錄因子及 RNA polymerase II 便較容易接近 DNA，通常促進基因表現。

反之，去乙醯化會恢復正電荷，使染色質較緊密，通常造成轉錄抑制。

2. 建立活化或抑制性的組織蛋白標記

不同修飾位置具有不同功能，形成組織蛋白密碼（histone code）：

核心觀念

本題考查兩個重點：

1. 胞嘧啶脫氨基造成的鹼基轉換突變

• 胞嘧啶（cytosine, C）脫氨基後形成尿嘧啶（uracil, U）。
• $5$-甲基胞嘧啶（$5$-methylcytosine, 5mC）脫氨基後形成胸腺嘧啶（thymine, T）。
• 5mC 常存在於 CpG dinucleotide，因此與 CpG 突變熱點密切相關。

2. DNA 甲基化的檢測

• 最具代表性的實驗是 亞硫酸氫鹽定序（bisulfite sequencing）。
• 其核心是區分「未甲基化的 C」與「甲基化的 5mC」。

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（一）為何 5-甲基胞嘧啶較容易形成 DNA 突變熱點？

1. 胞嘧啶與 5-甲基胞嘧啶的脫氨基產物不同

胞嘧啶脫氨基反應如下：

$$\text{C} \xrightarrow{\text{deamination}} \text{U}$$

5-甲基胞嘧啶脫氨基反應如下：

$$\text{5mC} \xrightarrow{\text{deamination}} \text{T}$$

兩者所造成的 DNA 配對錯誤分別為：

$$\text{U:G mismatch}$$

以及

$$\text{T:G mismatch}$$

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2. 胞嘧啶脫氨基形成的 U:G 錯配較容易被修復

尿嘧啶並非正常 DNA 的鹼基。細胞具有尿嘧啶 DNA glycosylase（UNG）等鹼基切除修復系統，可辨認 DNA 中的 U，將其移除，再經由 DNA repair pathway 修補。

因此：

$$\text{C}\rightarrow\text{U}$$

雖然會暫時形成 U:G 錯配，但通常容易被細胞辨識並修復，突變較不容易固定。

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3. 5mC 脫氨基形成 T，較難被辨識為異常鹼基

胸腺嘧啶本來就是 DNA 的正常鹼基。因此，5mC 脫氨基後形成的 T 會與對股的 G 形成：

$$\text{T:G mismatch}$$

此錯配不像 U:G 錯配那樣容易被辨認為「DNA 中出現了不應有的鹼基」。雖然細胞具有 T:G mismatch-specific glycosylase 等修復機制，但其修復效率與辨識正確性通常不如對 U 的清除。

因此，部分 T:G 錯配可逃避免疫式的 DNA 修復，經過 DNA 複製後固定為鹼基替換：

$$\text{5mC:G} \longrightarrow \text{T:G} \longrightarrow \text{T:A}$$

這是典型的轉換型突變：

$$\text{C:G}\rightarrow\text{T:A}$$

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4. CpG 位點常有 5mC，因此形成突變熱點

真核生物 DNA 的甲基化主要發生在 CpG dinucleotide 的胞嘧啶上：

$$5'\text{-}CG\text{-}3'$$

當其中的 C 被甲基化為 5mC 後，若發生自發性脫氨基：

$$5'\text{-}5mCG\text{-}3' \longrightarrow 5'\text{-}TG\text{-}3'$$

經過複製與錯配修復失敗後，會造成：

$$\text{CpG}\rightarrow\text{TpG}$$

或互補股上的：

$$\text{CpG}\rightarrow\text{CpA}$$

因此，CpG 位點的 $C\rightarrow T$ 轉換在基因體中出現頻率特別高，成為常見的 DNA 突變熱點。

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5. 得分關鍵整理

5mC 較容易形成突變熱點，應完整寫出下列因果鏈：

$$\text{5mC 脫氨基} \rightarrow \text{T:G 錯配} \rightarrow \text{T 為正常 DNA 鹼基，較不易被辨識} \rightarrow \text{錯配修復失敗} \rightarrow \text{複製後固定為 C:G}\rightarrow\text{T:A}$$

相對地：

核心觀念

本題考查「反轉錄即時定量聚合酶鏈式反應」$RT\text{-}qPCR$ 的原理、相較於一般 PCR 的優點，以及循環閾值 $C_\text{t}$ 的定義。

新冠肺炎病毒 SARS-CoV-2 的遺傳物質為單股 RNA，因此檢測流程通常包括：

1. RNA 萃取。
2. 以反轉錄酶將病毒 RNA 轉換為互補 DNA（complementary DNA, cDNA）。
3. 以特異性引子進行 PCR 擴增。
4. 透過螢光訊號即時監測產物累積，判定檢體中是否含有目標病毒核酸。

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解題方法

作答時可依序掌握三個層次：

• （一）說明「如何產生螢光，以及螢光如何反映目標核酸的擴增」。
• （二）從「即時監測、定量能力、操作流程、特異性與污染控制」比較一般 PCR。
• （三）明確寫出 $C_\text{t}$ 是「螢光訊號首次超過設定閾值時所需的循環數」。

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（一）即時聚合酶鏈式反應之原理

1. 反轉錄形成 cDNA

病毒 RNA 經反轉錄酶作用，形成與病毒 RNA 互補的 cDNA。由於 PCR 本身以 DNA 作為模板，RNA 病毒必須先經過此步驟，故稱為反轉錄即時 PCR，即 $RT\text{-}qPCR$。

2. 特異性 PCR 擴增

反應混合物通常包含：

• 病毒 RNA 或反轉錄形成的 cDNA 模板；
• 針對病毒特定基因區域設計的正向與反向引子；
• DNA 聚合酶；
• 脫氧核苷三磷酸（dNTPs）；
• 反應緩衝液及鎂離子；
• 螢光染劑或螢光探針。

PCR 每一循環包括：

1. 變性（denaturation）：雙股 DNA 分離成單股。
2. 退火（annealing）：引子與互補的目標序列結合。
3. 延伸（extension）：DNA 聚合酶以模板延伸新生 DNA 股。

經過反覆循環後，目標 DNA 片段以近似指數方式增加。

3. 螢光訊號即時偵測

常見方法為 TaqMan 螢光探針法。探針具有：

• 位於一端的報導螢光染劑（reporter）；
• 位於另一端的淬熄染劑（quencher）。

探針完整存在時，報導螢光受到淬熄作用，訊號很弱。當探針與目標序列結合，DNA 聚合酶延伸時會利用其 5′→3′ 核酸外切酶活性切解探針，使報導染劑與淬熄染劑分離，螢光訊號因此增強。

儀器在每一循環讀取螢光強度，建立「循環數—螢光訊號」曲線。若螢光訊號依特定曲線上升並超過設定閾值，即表示檢體含有與引子、探針相符的目標核酸。

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（二）相較於一般 PCR 反應之優點

1. 可即時監測擴增反應

一般 PCR 通常在反應結束後，利用瓊脂糖凝膠電泳觀察是否出現預期大小的 DNA 片段；即時 PCR 則在每一循環同步偵測螢光，不必等到反應結束才分析。

2. 具有定量能力

即時 PCR 可依據螢光曲線及 $C_\text{t}$ 值，估算樣本中初始目標核酸量。一般 PCR 多半只能判斷「有無產物」，定量能力較有限。

3. 靈敏度高、線性範圍廣

在適當的反應條件下，即時 PCR 可偵測低含量的目標核酸，且能在一定範圍內反映初始模板量的差異。

4. 特異性較高

若採用 TaqMan 探針，必須同時符合引子與探針的辨識條件，較能降低非特異性產物造成的誤判。若使用 SYBR Green，則主要依靠雙股 DNA 染劑，特異性通常低於探針法，仍須配合熔解曲線分析。

5. 減少操作步驟與交叉污染

即時 PCR 多在密閉反應管內完成擴增與偵測，不需於反應後開管進行電泳，因此可減少擴增產物逸散及實驗室交叉污染。

6. 節省時間與人力

不需要另行製膠、電泳、染色及判讀條帶，通常可直接由儀器產生擴增曲線與結果。