110 地方特考四等 衛生技術 生物技術學概要 考古題詳解

核心觀念

肽鏈核酸 PCR（peptide nucleic acid PCR, PNA-PCR）主要是利用人工合成的肽鏈核酸探針，抑制特定 DNA 模板的 PCR 擴增，以提高目標序列的選擇性與突變辨識能力。

PNA 是以中性肽鏈骨架取代 DNA 的磷酸二酯骨架，其鹼基仍可依照 Watson–Crick 配對原則，與互補的 DNA 或 RNA 序列形成穩定雙股結構。由於 PNA 骨架不帶負電荷，PNA 與 DNA 的結合通常具有下列特性：

1. 與互補序列的結合親和力高。
2. 對單一鹼基錯配的辨識能力強。
3. 不易受到相鄰 DNA 磷酸負電荷的靜電排斥影響。
4. PNA 本身通常不能被一般 DNA 聚合酶延伸。

因此，PNA-PCR 最重要的概念是「以 PNA 阻斷不希望被擴增的模板，使 PCR 優先擴增目標模板」。

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解題方法：PNA-PCR 的基本原理

典型的 PNA-PCR 又稱為 PNA clamping PCR，操作時會在一般 PCR 反應液中加入一條特定序列的 PNA oligomer，並同時加入：

• PCR 正向引子與反向引子
• DNA 模板
• 耐熱 DNA 聚合酶
• dNTP
• 緩衝液及適當的鎂離子
• 與野生型序列互補的 PNA 探針

其反應流程如下。

第一步：DNA 變性

加熱使雙股 DNA 分離成兩條單股 DNA：

$$\text{dsDNA} \xrightarrow{\text{高溫}} \text{ssDNA}$$

第二步：PNA 與特定序列結合

降溫後，PNA 會優先與其完全互補的 DNA 序列結合。若 PNA 設計成與野生型序列完全互補，則野生型模板會形成穩定的 PNA–DNA 雙股結構：

$$\text{PNA} + \text{野生型 DNA} \longrightarrow \text{穩定 PNA–DNA 複合體}$$

PNA 結合的位置通常選在 PCR 引子要結合的區域，或選在靠近引子結合區、能夠阻止聚合酶通過的位置。

第三步：抑制野生型模板擴增

PNA 佔據野生型 DNA 的特定序列後，會產生兩種阻斷效果：

1. 阻止 PCR 引子結合：若 PNA 與引子結合區重疊，引子無法有效退火。
2. 阻止 DNA 聚合酶延伸：即使引子已結合，PNA 所形成的穩定結構也會妨礙聚合酶沿模板進行延伸。

由於 PNA 不能像一般 DNA 引子一樣被 DNA 聚合酶延伸，因此 PNA 主要扮演「阻斷分子」的角色，而非擴增引子。

第四步：選擇性擴增突變型模板

若突變型 DNA 在 PNA 的辨識位置具有單一鹼基變化，PNA 與突變型序列之間會形成錯配，結合穩定度顯著下降。於退火條件下，PNA 不易穩定佔據突變型模板，PCR 引子即可結合，DNA 聚合酶也能順利延伸：

$$\text{突變型 DNA} \xrightarrow{\text{PNA 結合弱}} \text{引子退火} \xrightarrow{\text{DNA 聚合酶}} \text{突變序列擴增}$$

因此，經過多個 PCR 循環後，突變型模板會被大量擴增，而野生型模板受到 PNA 抑制。其選擇性可表示為：

$$\text{突變型擴增訊號} \gg \text{野生型擴增訊號}$$

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PNA-PCR 的循環過程

每一個 PCR 循環包括：

1. 高溫變性：分離 DNA 雙股。
2. 降溫退火：PNA 與完全互補的野生型序列結合，PCR 引子與未被阻斷的突變型模板結合。
3. 延伸：DNA 聚合酶延伸已退火的 PCR 引子；被 PNA 阻斷的野生型模板無法有效延伸。

重複上述循環後，未被 PNA 阻斷的目標序列呈現指數式擴增：

$$N_n=N_0(1+E)^n$$

其中 $N_0$ 為初始模板量，$E$ 為每一循環的擴增效率，$n$ 為循環數。PNA-PCR 的關鍵不在於改變 PCR 的基本擴增機制，而在於利用 PNA 的高親和力與高錯配辨識能力，選擇性降低特定模板的擴增效率。

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核心觀念

本題考查三個重點：

1. 單株抗體的來源與基因工程製造。
2. Trastuzumab 的「人源化」設計。
3. 赫賽汀的分子特性、作用標的與抗癌機制。

Trastuzumab 是一種針對人類表皮生長因子受體第二型（human epidermal growth factor receptor 2, HER2；又稱 ErbB2）的重組人源化單株抗體，主要用於 HER2 過度表現的乳癌治療。

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一、赫賽汀單株抗體的製造

（一）抗原與鼠源抗體的取得

HER2 是一種位於細胞膜上的受體型酪胺酸激酶，部分乳癌細胞會大量表現 HER2，使細胞增殖及存活訊號增強。

製造 Trastuzumab 的起始抗體為鼠源單株抗體 4D5，基本流程如下：

1. 以 HER2 抗原免疫小鼠。
2. 取出小鼠脾臟中的 B 淋巴球。
3. 將 B 淋巴球與可無限增殖的骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤（hybridoma）。
4. 以選擇培養基篩選融合細胞。
5. 以 ELISA、流式細胞分析或細胞結合試驗，篩選能特異性結合 HER2 的細胞株。
6. 進行單細胞克隆，建立可穩定分泌單一抗體的細胞株。

此階段所得的 4D5 抗體具有良好抗 HER2 活性，但完整鼠源抗體直接用於人體，容易誘發人抗鼠抗體反應（human anti-mouse antibody, HAMA）。

（二）人源化抗體設計

Trastuzumab 採用互補性決定區移植技術（complementarity-determining region grafting, CDR grafting）。

抗體可分為：

• 可變區：負責辨識抗原。
• 恆定區：負責與免疫細胞及補體作用。

人源化的主要步驟為：

1. 確認鼠源 4D5 抗體的抗原結合區，特別是重鏈及輕鏈的 CDR。
2. 保留鼠源抗體的 CDR，以維持對 HER2 的特異性與親和力。
3. 將 CDR 移植到人類抗體的框架區（framework region）上。
4. 連接人類 IgG1 重鏈恆定區及人類 κ 型輕鏈恆定區。
5. 以基因工程方式建立完整的人源化抗體基因。

因此，Trastuzumab 的抗原辨識區源自鼠源 4D5，但抗體的大部分結構為人類來源，屬於人源化單株抗體，而非完整鼠源抗體。

（三）重組細胞株與培養

將人源化抗體的重鏈、輕鏈基因導入哺乳動物細胞，通常使用中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell, CHO）建立穩定表現細胞株。

CHO 細胞適合作為治療性抗體生產系統，原因包括：

• 能正確摺疊抗體蛋白。
• 能形成重鏈與輕鏈間的雙硫鍵。
• 能進行哺乳動物型醣基化。
• 可進行大規模懸浮培養。
• 具有成熟的生物製劑生產與品質管制技術。

重組 CHO 細胞會分泌完整的 Trastuzumab 至培養液中，再經由生物反應器進行放大培養。

（四）抗體純化與製劑化

主要製程包括：

1. 細胞培養與收穫：在無菌生物反應器中培養 CHO 細胞。
2. 澄清與過濾：移除細胞、細胞碎片及懸浮雜質。
3. 親和性純化：利用 Protein A 與 IgG Fc 區的親和性，捕捉 Trastuzumab。
4. 病毒去除與病毒滅活：透過低 pH 處理、病毒過濾等步驟降低病毒污染風險。
5. 離子交換及其他層析：去除宿主細胞蛋白、DNA、聚集體及其他製程雜質。
6. 濃縮與緩衝液置換：調整抗體濃度與適當的製劑環境。
7. 無菌充填：製成注射用製劑。

品質管制項目包括抗原結合能力、純度、聚集程度、醣基化型態、宿主細胞蛋白殘留、DNA 殘留、無菌性、內毒素及生物活性。

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二、赫賽汀單株抗體的分子特性

（一）抗體類型

Trastuzumab 具有下列特性：

• 人源化單株抗體。
• 同型為人類 IgG1。
• 輕鏈類型為 κ 型。
• 具有兩條相同重鏈與兩條相同輕鏈。
• 以雙硫鍵連結重鏈與輕鏈。
• Fc 區可與免疫效應細胞上的 Fcγ 受體結合。
• 為醣蛋白，具有哺乳動物細胞所產生的醣基化結構。
• 分子量約為 148 kDa。

（二）抗原特異性

Trastuzumab 可特異性結合 HER2 胞外區的第 IV 次結構域（subdomain IV），抑制 HER2 受體相關訊號。

其辨識具有高度專一性，主要作用於 HER2 過度表現或基因擴增的腫瘤細胞，因此治療前通常須以免疫組織化學染色及原位雜交等方法確認腫瘤的 HER2 狀態。

（三）人源化的意義

與完整鼠源抗體比較，人源化抗體具有下列優點：

• 降低人體對異種蛋白的免疫反應。
• 降低 HAMA 形成。
• 適合重複給藥。
• 延長體內使用的可行性。
• 保留鼠源抗體的抗原辨識能力。

人源化並不代表百分之百由人類序列組成，Trastuzumab 仍保留鼠源 CDR，因此仍具有少量異源性。

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核心觀念

本題考查藥物基因體學中 HLA 分型的兩大技術：

1. 血清學分型（serological typing）：利用已知特異性的抗 HLA 抗體，辨認細胞表面的 HLA 抗原。
2. 核酸分子分型（molecular typing）：利用 PCR、核酸雜交或 DNA 定序，直接分析 HLA 基因的特定序列與等位基因。

HLA 屬於高度多型性的主要組織相容性複合體（major histocompatibility complex, MHC）分子。藥物或其代謝物與特定 HLA 分子結合後，可能被 T 細胞辨識，誘發嚴重免疫反應，例如史蒂文生強森症候群（Stevens–Johnson syndrome, SJS）及毒性表皮壞死溶解症（toxic epidermal necrolysis, TEN）。

臨床上常以特定 HLA 等位基因作為藥物不良反應的風險標記，例如：

• HLA-B*15:02：與部分族群使用 carbamazepine 發生 SJS/TEN 相關。
• HLA-B*58:01：與 allopurinol 引發嚴重皮膚不良反應相關。

因此，HLA 分型的重點不只是判定組織相容性，也可用於用藥前風險篩檢及個人化用藥。

解題方法

作答時應依序說明：

1. HLA 分型所要辨認的對象。
2. 血清學分型使用的材料、反應原理與判讀方式。
3. 核酸分子檢測分析的對象、常見方法與結果判讀。
4. 比較兩種方法的優缺點及臨床應用價值。

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一、血清學分型

1. 基本原理

血清學分型是利用已知專一性的抗 HLA 抗體，與待測者淋巴球表面的 HLA 抗原結合，再藉由補體依賴性細胞毒殺反應判斷該抗原是否存在。

最典型的方法為微量淋巴球細胞毒殺試驗（microlymphocytotoxicity test），也稱為補體依賴性淋巴球細胞毒殺試驗。

2. 實驗步驟

（1）取得待測細胞

由受檢者血液分離淋巴球：

• HLA class I：存在於幾乎所有有核細胞，因此可使用混合淋巴球。
• HLA class II：主要表現在 B 淋巴球、單核球及其他抗原呈現細胞，因此通常需分離 B 淋巴球或富含 class II 的細胞群。

（2）加入已知抗 HLA 抗體

將受檢者淋巴球分裝至微量反應盤中，分別加入多種已知專一性的抗 HLA 抗血清。

每一種抗血清代表一組已知的 HLA 抗原特異性，例如針對某些 HLA-A、HLA-B 或 HLA-DR 抗原的抗體。

（3）加入補體

抗體與細胞表面 HLA 抗原結合後，加入補體。若抗體確實辨認細胞上的相應 HLA 抗原，會啟動補體級聯反應，形成膜攻擊複合體，使細胞膜破裂。

（4）判斷細胞存活

加入染料觀察細胞是否死亡：

• 細胞膜完整、排斥染料：表示細胞存活。
• 細胞膜受損、吸收染料：表示細胞死亡。

若加入某一抗血清與補體後造成細胞死亡，表示待測細胞表面具有該抗血清所辨認的 HLA 抗原。

可用下式概念表示：

$$\text{HLA 抗原}+\text{特異性抗體}+\text{補體} \rightarrow \text{細胞膜破壞}\rightarrow \text{細胞死亡}$$

3. 判讀方式

血清學分型的判讀不是單純看單一抗體是否反應，而是將整組抗血清的陽性、陰性反應型態，與已知 HLA 抗原反應表比較，據以推定受檢者的 HLA 型別。

由於每個人通常具有來自父母的兩套 HLA 基因，因此細胞表面可能同時表現兩種不同的 HLA 抗原。分型結果也可能受到抗原表現量、抗體專一性及交叉反應影響。

4. 優點與限制

優點：

• 技術原理直觀。
• 可直接辨認細胞表面的 HLA 抗原。
• 適合早期組織配對及移植相關分型。

限制：

• 需要品質良好且具有活性的淋巴球。
• 需要大量已知專一性的抗血清。
• 抗體可能產生交叉反應，造成判讀困難。
• 只能辨認可被抗體區分的抗原群，無法充分分辨分子層級的細微等位基因差異。
• HLA 抗原表現量不足時，可能產生偽陰性。
• 不適合直接精確判定與藥物不良反應相關的特定細小等位基因。

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二、核酸分子檢測

1. 基本原理

核酸分子分型直接分析受檢者的 HLA DNA 序列，辨認不同等位基因之間的鹼基差異。

HLA 基因高度多型，尤其抗原結合區域的序列差異，會影響其與藥物、藥物代謝物及 T 細胞受體的交互作用。因此，分子檢測能以較高解析度判定特定 HLA 等位基因。

基本流程如下：

$$\text{抽取 DNA} \rightarrow \text{PCR 增幅} \rightarrow \text{辨識特異序列} \rightarrow \text{判定 HLA 等位基因}$$

2. DNA 萃取

由全血、口腔拭子或其他含有核細胞的檢體取得基因組 DNA。由於分析的是 DNA，檢體不一定需要保持活細胞狀態，這是分子分型相較於血清學分型的重要優勢。

3. PCR-SSP

PCR-SSP 為序列專一性引子 PCR（sequence-specific primer PCR）。

原理

設計一對只在特定 HLA 等位基因序列完全匹配時才能有效延伸的引子。PCR 後：

核心觀念

本題考查民國 110 年 2 月 9 日修正發布之《特定醫療技術檢查檢驗醫療儀器施行或使用管理辦法》（以下簡稱特管辦法）中：

1. 附表三所列之 6 項自體細胞治療技術及其適應症。
2. 附表四所列之 7 大類實驗室開發檢測（Laboratory Developed Tests, LDTs）。

依特管辦法第 2 條：

• 細胞治療技術：使用未結合藥物之人體細胞組織物，以重建人體構造、機能或治療疾病之技術。
• 實驗室開發檢測：為診察、診斷或治療特定病人或疾病，由認證實驗室自行建立及使用之檢測。

本題應以命題當年，即民國 110 年法規及附表三、附表四內容為準。

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解題方法

作答時可依「細胞來源或種類—治療目的—適應症」整理 6 項細胞治療；再依「檢測用途」整理 7 項 LDT。細胞治療部分必須同時寫出技術名稱與適用對象，不能只列細胞種類；LDT 部分則應完整列出附表四的 7 大類。

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一、6 項自體細胞治療技術及適用對象

1. 自體 CD34+ selection 周邊血幹細胞治療

適用對象：

• 慢性缺血性腦中風。
• 嚴重下肢缺血症。

此技術係自病人周邊血分離、選取 CD34 陽性細胞，再回輸至病人體內，主要著重於血管新生及組織修復。

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2. 自體免疫細胞治療

適用對象：

• 血液惡性腫瘤，且經標準治療無效。
• 第一期至第三期實體癌，且經標準治療無效。
• 實體癌第四期。

自體免疫細胞治療可包括 CIK、NK、DC、DC-CIK、TIL 及 gamma-delta T 細胞等。作答時，重點在於「癌症類型及治療狀態」，而不是只寫出免疫細胞名稱。

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3. 自體脂肪幹細胞治療

適用對象：

• 慢性或滿 6 週未癒合之困難傷口。
• 占總體表面積百分之 20 以上之大面積燒傷或皮膚創傷受損。
• 皮下及軟組織缺損。
• 退化性關節炎及膝關節軟骨缺損。

脂肪幹細胞具有組織修復及分化潛能，因此適應症涵蓋傷口、燒傷、軟組織及關節軟骨損傷。

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4. 自體纖維母細胞治療

適用對象：

• 皮膚缺陷，包括皺紋、凹洞及疤痕之填補與修復。

纖維母細胞與膠原蛋白及細胞外基質形成有關，因此主要應用於皮膚缺陷的修復，而非一般疾病治療或廣泛美容療程。

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5. 自體骨髓間質幹細胞治療

適用對象：

• 退化性關節炎及膝關節軟骨缺損。
• 脊髓損傷。

骨髓間質幹細胞具有組織修復及免疫調節功能，適用於關節軟骨及神經組織損傷之修復性治療。

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6. 自體軟骨細胞治療

適用對象：

• 膝關節軟骨缺損。

此技術係取出病人自身軟骨細胞，於體外培養增殖後，再植回受損之膝關節軟骨部位，以達到軟骨修復目的。

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二、7 項實驗室開發檢測項目

1. 抗癌瘤藥物之伴隨檢測

用以判斷病人是否具有接受特定抗癌藥物所需的生物標記或基因特徵，以協助選擇適合的標靶藥物或其他抗癌治療。

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2. 癌症篩檢、診斷、治療及預後之基因檢測

包括癌症相關基因突變、基因融合或其他分子變異之檢測，可應用於：

• 癌症篩檢。
• 癌症診斷及分類。
• 治療方式選擇。
• 疾病復發或預後評估。

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