107 高普考普通考試 環境檢驗 環境微生物學概要 考古題詳解

核心觀念

本題旨在測驗考生對於環境檢驗微生物操作中，最基礎且核心之**「無菌操作技術（aseptic technique）」與「劃線平板法（streak plate method）」**的原理及實務操作掌握度。

1. 基本原理（機械性連續稀釋）：環境樣本（如受污染水體、土壤懸浮液）通常含有高密度且多元的混合菌相。劃線法係藉由金屬接菌環（接種環）在固體洋菜培養基表面進行物理性劃線，使菌體細胞在固體表面逐漸分散，沿劃線方向產生「連續稀釋」之效果。
2. 單一菌落（Isolated Colony）與純化：劃線至後續區域時，微生物細胞已被稀釋至個別孤立狀態（即單一菌落形成單位，Colony Forming Unit, $\text{CFU}$）。在合適條件下培養後，單一細胞分裂增殖形成肉眼可見的單一菌落（純培養物，Pure culture）。
3. 無菌操作要件：操作全程需維持無菌防護（酒精燈火焰無菌區、超淨工作台），每換一區劃線前接菌環必須徹底灼燒滅菌並充分冷卻，以確保稀釋效果，並防止外來雜菌污染。

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解題方法

本題為標準的實驗操作申論題。閱卷委員主要評閱考生是否具備「完整的無菌概念」與「規範化的操作邏輯」。答題時切忌僅寫出劃線手勢，應涵蓋四個完整階段：

1. 實驗前置準備與環境控制（器材準備、標示、無菌區建立）。
2. 取菌與劃線程序（以公職考試評分標準之「四區劃線法，Quadrant streak method」為最佳架構，詳述每一區的交互作用與滅菌步驟）。
3. 培養條件設定（倒置培養之原因及溫濕度控制）。
4. 結果檢視與後續純化確認（挑取單一菌落進行繼代二次劃線）。

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選項分析

本題為申論題，非選擇題。試卷評分關鍵指標如下：

• 關鍵給分點一（操作順序與滅菌）：接菌環於初次取樣前、每一次跨區劃線前、以及操作完畢後，皆必須在酒精燈火焰上燒至「紅熱（red-hot）」滅菌，且取菌前必須於洋菜無菌邊緣「冷卻」，否則高溫會殺死待測菌。
• 關鍵給分點二（跨區劃線邏輯）：第二區以後之劃線，必須自前一區劃線末端帶出 $2\sim 3$ 條線，不可重複返回前區或重回原檢液取樣；第四區劃線絕對不可接觸到第一區。
• 關鍵給分點三（倒置培養理由）：培養皿必須「倒置（皿底朝上、皿蓋朝下）」，避免水蒸氣凝結於皿蓋後滴落洋菜表面，導致已分散之菌體重新混流而無法形成單一菌落。

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解題技巧

1. 版面架構條列化：實驗步驟題務必使用標號（一、二、三…或 1、2、3…），步驟邏輯清楚，考官能在 10 秒內抓出給分關鍵詞。
2. 必背關鍵字彙：四區劃線（Quadrant streak）、無菌操作（Aseptic technique）、灼燒紅熱滅菌、充分冷卻、單一菌落形成單位（CFU）、倒置培養（Inverted incubation）。
3. 常見失分陷阱：

• 忘記寫「接菌環需冷卻」即取菌（導致微生物熱死）。
• 跨區劃線時寫成「接菌環重新沾取檢液」（完全破壞稀釋作用，直接零分）。
• 劃線力道描述錯誤（若用力過猛刺破洋菜凝膠，菌體會陷入凝膠內無法形成表面分離菌落）。

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【答案】

現有環境樣本欲以傳統劃碟法（streak plate method）進行微生物分離純化，標準實驗步驟如下：

核心觀念

本題測驗環境微生物學在「地球化學歷史與微生物演化」領域的核心命題重點，涉及以下關鍵觀念與生化反應機制：

1. 原始地球環境與大氣組成：前寒武紀早期地球大氣為缺乏游離氧（$\mathrm{O_2}$）的強還原性環境，主要由 $\mathrm{N_2}$、$\mathrm{CO_2}$、$\mathrm{H_2O}$、$\mathrm{CH_4}$ 及少量的 $\mathrm{H_2S}$、$\mathrm{NH_3}$ 等氣體組成。
2. 產氧光合作用（Oxygenic Photosynthesis）的演化：微生物由利用還原態硫化物（如 $\mathrm{H_2S}$）的不產氧光合作用，演化出能裂解水分子（$\mathrm{H_2O}$）作為電子予體、並釋放 $\mathrm{O_2}$ 的產氧光合作用。
3. 內共生學說（Endosymbiotic Theory）：真核宿主細胞吞噬具光合能力的藍細菌祖先，形成原始葉綠體，演化出真核藻類，大幅強化全求光合產氧與固碳能量。
4. 大氧化事件（Great Oxidation Event, GOE）與大氣成分轉變：游離氧累積、帶狀鐵礦層（Banded Iron Formations, BIFs）沉積、溫室氣體（$\mathrm{CO_2}$、$\mathrm{CH_4}$）消耗，以及高空臭氧層（$\mathrm{O_3}$）的屏蔽生成。

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解題方法

本題為國家考試環境檢驗類科典型的「申論問答題」，作答切入點應分為兩大部分：

1. 辨識並定名兩種微生物：

• 第一種微生物為原核生物界之藍綠菌／藍細菌（Cyanobacteria），為地球歷史上最早演化出「產氧光合作用」的生物。
• 第二種接續出現的微生物為原生生物界之真核藻類（Eukaryotic Algae），透過內共生作用取得葉綠體後，於全球海洋擴展光合作用能量。

2. 條列說明改變大氣成分的機制與歷程：

• 採「化學反應方程式」結合「地質大氣組成分變化」循序推導，分別針對氧氣累積、二氧化碳降低、甲烷氧化、臭氧層生成進行因果分析。

完整解題推導

一、兩種接續出現的微生物

1. 第一種：藍細菌（Cyanobacteria，舊稱藍綠菌或藍綠藻）

• 出現於約 27 至 30 億年前（太古代晚期至元古代早期），為最早具有光系統 I（PSI）與光系統 II（PSII）之原核微生物。

2. 第二種：真核微藻／真核藻類（Eukaryotic Algae）

• 出現於約 15 至 18 億年前（元古代中期），由厭氧或好氧的原始單細胞真核生物經「初級內共生」（Primary Endosymbiosis）吞噬產氧藍細菌後演化而成，具備高度分化的膜狀胞器（葉綠體）。

二、這兩種微生物改變大氣成分的機制與過程

1. 釋放氧氣（$\mathrm{O_2}$）並引發「大氧化事件」

• 生化反應：藍細菌與真核藻類進行產氧光合作用，利用水分子（$\mathrm{H_2O}$）作為電子供體，並經由水分解複合物（Oxygen-Evolving Complex, OEC）催化水的光解： $6\mathrm{CO_2} + 6\mathrm{H_2O} \xrightarrow{h\nu} \mathrm{C_6H_{12}O_6} + 6\mathrm{O_2}\uparrow$
• 地質緩衝至大氣釋出：早期光合作用釋放的 $\mathrm{O_2}$ 首先被海水中溶解的亞鐵離子（$\mathrm{Fe^{2+}}$）與還原性礦物吸收，沉澱形成「帶狀鐵礦層」（Banded Iron Formations, BIFs）： $4\mathrm{Fe^{2+}} + 3\mathrm{O_2} + 6\mathrm{H_2O} \to 2\mathrm{Fe_2O_3}\downarrow + 12\mathrm{H^+}$ 待環境中還原劑消耗殆盡後（距今約 24 至 22 億年前），游離氧氣開始向大氣釋放並累積，促成「大氧化事件」（Great Oxidation Event, GOE）。隨後真核藻類出現，更進一步將大氣氧含量推升至接近現今大氣水平（約 21%）。

2. 大量固定二氧化碳（$\mathrm{CO_2}$）

• 這兩種微生物利用卡爾文循環（Calvin Cycle）中的關鍵酵素 RuBisCO，將原始大氣中高濃度的 $\mathrm{CO_2}$ 固定為有機碳（糖類與生物質量），死後部分沉降轉化為碳酸鹽岩與沉積有機質，大幅降低了原始大氣的 $\mathrm{CO_2}$ 分壓，削弱

核心觀念

本題考查環境微生物學中「分子生物學鑑定技術（Molecular Identification）」之核心原理與標準實驗流程。相較於傳統依賴培養特徵與生理生化試驗（如 API 鑑定套組、選擇性培養基）的繁瑣與限制，現代分子鑑定直接針對微生物基因體中的**專一性標的序列（Target sequence）**進行分析。

1. 標的基因選擇原理：

• 細菌與古細菌：普遍採用 $16\text{S rRNA}$ 基因（$16\text{S rDNA}$），長度約 $1,500\text{ bp}$。其序列具有「高度保留區（Conserved regions）」與「高變異區（Hypervariable regions, V1–V9）」。保留區可作為設計通用引子（Universal primers）之結合位點；高變異區則保留各屬、種之間的序列差異，用於種屬辨識。
• 真菌：常採用核糖體 DNA 之**內部轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer, ITS）**或 $18\text{S}/28\text{S rRNA}$ 基因之特定變異區（如 D1/D2 domain）。
• 病毒：常針對外殼蛋白基因或核酸複製酶（如 RdRp）等保留基因。

2. 鑑定核心流程四大主軸：核酸萃取（Extraction） $\rightarrow$ 標的基因聚合酶連鎖反應（PCR Amplification） $\rightarrow$ 基因定序（DNA Sequencing） $\rightarrow$ 生物資訊比對與親緣分析（Bioinformatics & Phylogenetics）。

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解題方法

本題為標準申論題，作答策略應採取標準實驗室標準作業程序（SOP）之時序開展，層次分明地交代各步驟的技術內容與目的，展現工整的答題架構：

1. 樣品採集與核酸純化：破壞細胞壁釋出染色體 DNA，並去除蛋白質、腐植酸等 PCR 抑制物。
2. 標的基因 PCR 擴增：利用通用引子專一性複製目標片段。
3. 產物確認與定序：電泳檢測後，以桑格定序（單一純菌）或次世代定序（複合環境檢體）讀取鹼基序列。
4. 生物資訊比對與菌種判定：透過國際公開資料庫進行序列比對，依據相似度門檻判定分類位階。
5. 親緣關係分析：建構親緣關係樹，確認演化距離。

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選項分析

本題為公職專門技術人員／公務人員高普考之非選擇題（申論問答題），無選項供選。評分關鍵在於能否精準列舉標的基因名稱、各階段技術名詞及鑑定比對之判定原則，答題需兼顧流程完整度與學理深度。

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解題技巧

1. 專有名詞關鍵字必須齊備：閱卷重點在於是否有精確寫出「$16\text{S rRNA}$ 基因」、「通用引子（如 27F/1492R）」、「聚合酶連鎖反應（PCR）」、「雙去氧終止法定序（Sanger sequencing）」、「BLAST 序列比對」與「親緣關係樹（Phylogenetic tree）」。
2. 環境檢驗視角的延伸加分點：環境檢體（如土壤、受污染地下水）中超過 $99\%$ 的微生物屬於「現行技術不可培養菌（Viable But Non-Culturable, VBNC）」，答題時若能順帶點出傳統生化鑑定之侷限，並補充說明直接分析序列可克服不可培養問題（亦可擴展至次世代定序 Metagenomics），可提高專業立體度與得分級距。
3. 避免常見盲點：切忌只寫口語化的「抽取 DNA、拿去定序、比對電腦」。必須交代為什麼能定序（引子黏合保留區）與如何判定菌種（相似度閾值）。

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【答案】

現代利用基因序列差異鑑定微生物，主要以核糖體 RNA 基因（rDNA）為標的，其標準作業流程與進行方式可分為下列五大步驟：

一、 檢體製備與核酸萃取（DNA Extraction）

1. 細胞裂解（Cell Lysis）：針對採集之環境檢體或純化菌株，使用物理撞擊（玻璃珠破壁）、化學界面活性劑（如 SDS、CTAB）或酵素作用（溶菌酶 Lysozyme、蛋白酶 K）破裂細胞壁與細

核心觀念

本題的核心在於「活性污泥法之微生物族群動力學」與「操作參數對生化反應槽處理效能之關聯」。涉及的關鍵觀念與公式如下：

1. 污泥停留時間（Solids Retention Time, SRT，又稱泥齡 Sludge Age, $\theta_c$）： 定義為生物反應槽內活性微生物的平均滯留天數，公式為： $\theta_c = \frac{V \cdot X}{Q_w \cdot X_w + Q_e \cdot X_e}$ 其中 $V$ 為曝氣槽體積、$X$ 為槽內混合液懸浮固體濃度（MLSS）、$Q_w$ 與 $X_w$ 為每日廢棄污泥流量與濃度、$Q_e$ 與 $X_e$ 為放流水流量與懸浮固體濃度。
2. 微生物比生長速率與洗出極限（Washout）： 在穩定狀態下，微生物的比生長速率 $\mu$ 與泥齡 $\theta_c$ 成反比（考慮內生衰減係數 $b$）： $\mu = \frac{1}{\theta_c} + b$ 若某微生物族群的最大比生長速率 $\mu_{\max} < \frac{1}{\theta_c} + b$，該微生物在系統中增殖的速度追不上被排出的速度，將會被「洗出（Washout）」；反之，延長 $\theta_c$ 可降低系統所需的最低生長速率門檻，使生長緩慢的微生物得以在槽內累積並維持優勢。
3. 食微比（Food to Microorganism Ratio, $F/M$）： $F/M = \frac{Q \cdot S_0}{V \cdot X}$ 延長 $\theta_c$ 代表減少每日廢棄污泥量（$Q_w$ 降低），曝氣槽內微生物濃度 $X$ 上升，使 $F/M$ 顯著降低，生物反應進入內生呼吸期（Endogenous Respiration Phase）。

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解題方法

本題為非選擇題（申論問答題），採「動力學族群篩選 $\to$ 個別微生物生理行為 $\to$ 巨觀處理效果（正向與限制）」的系統性結構解答：

1. 第一部分（受影響的微生物）：以「比生長速率（$\mu$）」與「營養階層」為切入點，由微觀視角劃分為「緩慢生長菌（硝化菌）」、「異營菌生長狀態」、「高階微型動物（原生與後生動物）」以及「特殊/問題微生物（絲狀菌與聚磷菌）」。
2. 第二部分（可達到之生物處理效果）：以「水質淨化目標（有機物、氮、濁度）」與「工程操作特性（污泥量、耗氧）」為切入點，全面論述其正向效益與潛在之伴隨影響。

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詳細解題內容（問答分析）

一、 受到影響的微生物族群

延長污泥停留時間（$\theta_c$ 提高，如由傳統的 $3 \sim 5$ 天提高至 $10 \sim 25$ 天以上），槽內微生物生態將產生顯著轉變：

1. 自營性硝化細菌（Nitrifying Bacteria）——族群大量增殖並維持優勢

• 菌種：氨氧化菌（AOB，如 Nitrosomonas）與亞硝酸氧化菌（NOB，如 Nitrobacter、Nitrospira）。
• 影響機制：硝化菌為自營菌，利用無機碳（$\text{CO}_2$ 或碳酸氫根）合成細胞，產能效率低，最大比生長速率極小（世代時間長達 $20 \sim 40$ 小時）。在短泥齡系統中硝化菌會迅速被洗出；當延長 $\theta_c$ 大於硝化菌最小生長週期臨界值（通常要求 $\theta_c > 8 \sim 10\ \text{d}$，低水溫時需更長），硝化菌即可順利滯留並行完全硝化作用。

2. 異營性菌膠團細菌（Heterotrophic Bacteria）——進入內生呼吸與自氧化期

• 菌種：以 Pseudomonas、Zoogloea、Flavobacterium 等為主的異營菌。
• 影響機制：隨 $\theta_c$ 延長，$F/M$ 降低，進流水提供的基質（BOD）不足以維持對數生長，異營菌轉入「內生呼吸期（衰亡期）」。微生物開始消耗自身細胞內儲存物質及胞體蛋白進行自氧化（Self-oxidation/Cell lysis），細胞合成速率低於分解速率。

3. 微型動物（高階原生動物與後生動物）——數量與多樣性大幅增加

• 物種：固著型與匍匐型纖毛蟲（如 Vorticella 鐘形蟲、Carchesium 總鐘蟲）、輪蟲（Rotifers）及線蟲（Nematodes）。
• 影響機制：微型動物的世代時間遠長於細菌，需較長 $\theta_c$ 方能生長繁殖。牠們以游離細菌及細小懸浮顆粒為食，是活性污泥成熟與水質良好的關鍵生物指標。

4. 特殊與潛在致病微生物

• 聚磷菌（PAOs）受抑制：生物除磷需頻繁排出富磷剩餘污泥，長 $\theta_c$ 下排泥量減少，聚磷菌在內生呼吸期會二次釋磷，使蓄磷優勢消失。