107 高普考高考二級 衛生技術 生物化學 考古題詳解

核心觀念

本題屬於分子生物學中「基因表現調控機制」（RNAi、Ubiquitin）與「生化分子生物技術原理」（site-directed mutagenesis、ddNTP）之基礎且關鍵的核心考題，命題比重各占 10 分（合計 40 分）。

1. RNAi：真核生物利用雙股小分子 RNA 媒介的轉錄後基因靜默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）機制。
2. Ubiquitin：真核細胞內標記蛋白質進入 26S 蛋白酶體（proteasome）進行專一性降解之小分子胜肽，涉及 E1-E2-E3 酵素級聯系統。
3. Site-directed mutagenesis：在重組 DNA 質體中進行精準單一或多鹼基置換、插入或缺失的體外重組技術，核心為含突變引子之 PCR 與親代甲基化質體酵素消化。
4. ddNTP：去氧核糖之 $2'$ 與 $3'$ 位置皆缺失羥基（$-\text{OH}$）之核苷酸類似物，為 Sanger 定序法鏈終止（chain termination）之關鍵試劑。

---

解題方法

針對國家考試（高普考、公職醫檢師）每小題 10 分之申論題名詞解釋，評分指標著重於答題結構的完整性。應採用「四層次論述法」作答：

1. 中文譯名與基本定義（1～2 分）：點出全名、化學本質或發現背景。
2. 分子作用機制／化學結構（4～5 分）：詳述參與的關鍵酵素、化學鍵結（如磷酸二酯鍵、硫酯鍵、異胜肽鍵）及生化反應過程。
3. 細胞生理功能／生物學意義（2 分）：闡明在活體細胞內的調控目的與角色。
4. 生物技術或臨床醫學應用（2 分）：列舉實驗室研究方法或臨床藥物／診斷實例。

---

解題技巧

1. 閱卷亮點關鍵字必備：

• RNAi：dsRNA、Dicer、siRNA（21～23 nt）、RISC、Argonaute（Ago）、mRNA 切割與降解、轉譯阻遏。
• Ubiquitin：76 個胺基酸、高度保守、C 端 Gly76、E1（活化酶／硫酯鍵）$\to$ E2（結合酶）$\to$ E3（接合酶／受質專一性）、$\epsilon$-胺基異胜肽鍵（isopeptide bond）、Lys48 多泛素化與 26S 蛋白酶體。
• Site-directed mutagenesis：突變引子（mutagenic primers）、高保真聚合酶（Pfu）、線性質體擴增、DpnI 限制酶（特異性消化甲基化親代 DNA）、蛋白質工程與活性位點分析。
• ddNTP：缺失 $3'\text{-OH}$（呈 $3'\text{-H}$）、DNA 聚合酶、無法形成 $3'\to 5'$ 磷酸二酯鍵、專一性鏈終止（chain termination）、Sanger 定序法。

2. 常見失分陷阱：

• 誤將 RNAi 僅解釋為「抑制基因」，未提及「雙股 RNA」引發與「RISC / Dicer」核心機轉。
• Ubiquitin 僅寫出蛋白質降解，漏寫 E1-E2-E3 酵素級聯過程，或忽略非降解性信號（如 Lys63 連結參與 DNA 修復）。
• 定點突變只交代引子設計，未寫出如何利用 DpnI 酵素排除野生型親代 DNA 模板。
• ddNTP 誤寫成「核苷二磷酸」或未精確指出是「核糖 $2'$ 與 $3'$ 均缺氧」。

---

【答案】

(一) RNAi（RNA interference，RNA 干擾）

1. 定義與由來： RNAi 是真核生物細胞內由雙股 RNA（double-stranded RNA, dsRNA）分子引導同源 mRNA 發生專一性切割、降解或轉譯阻遏，進而導致特定基因表現下調之「轉錄後基因靜默（PTGS）」機制。此現象由 Andrew Fire 與 Craig Mello 於 1998 年在線蟲實驗中證實，並於 2006 年榮獲諾貝爾生理醫學獎。
2. 分子機制：

• 前驅物切割：外源性或內生性長鏈 dsRNA 進入細胞質後，被具 RNase III 結構域的核酸內切酶 Dicer 切割為長度約 21～23 個核苷酸對、末端帶有 2 個懸臂核苷酸（$3'$ overhang）的小干擾 RNA（siRNA）。
• 組裝至 RISC：siRNA 與蛋白質複合體結合形成 RISC（RNA-induced silencing complex）。RISC 中的核心催化單元為具內切酶活性的 Argonaute（Ago） 蛋白。
• 股分離與引導：雙鏈中熱力學較不穩定的「乘客股（passenger strand）」被 Ago 降解切除；而保留之「引導股（guide strand）」留在 RISC 內，依據鹼基互補配對原則尋找細胞質內的同源目標 mRNA。
• 靜默表現：
• 若 guide strand 與目標 mRNA 完全互補，Ago 催化目標 mRNA 切割，隨後由核酸外切酶迅速降解。
• 若僅部分互補（常見於微小 RNA, miRNA 路徑），則透過抑制核糖體轉譯延伸並加速去腺苷酸化達成基因靜默。

3. 生理意義與應用：

• 生理意義：真核細胞抵禦 RNA 病毒感染、抑制基因體內反轉座子（transposons）跳躍與維持染色質穩定之內生性防禦機制。
• 生技與醫學應用：
• 基礎研究：作為基因敲低（gene knockdown）工具，用於分析基因功能。
• 臨床治療：開發小核酸藥物（siRNA therapeutics），如治療遺傳性類澱粉沉積症之標靶藥物 Patisiran。

---

(二) Ubiquitin（泛素）

1. 分子結構特性： Ubiquitin 是一種由 76 個胺基酸所組成、分子量約 8.5 kDa 的小分子球狀蛋白質。其在真核生物演化過程中序列高度保守（酵母菌至人類僅相差 3 個胺基酸），其 C 端具有一對甘胺酸殘基（Gly75-Gly76），為催化偶聯之關鍵反應活性位點。

核心觀念

本題評量脂質代謝（Lipid Metabolism）、**能量恆定與荷爾蒙調控（Metabolic Homeostasis & Hormonal Regulation）以及肝臟酮體生成與利用（Ketogenesis & Ketolysis）**之生化機制。涉及的關鍵觀念包括：

1. 生酮飲食（Ketogenic Diet, KD）之定義與營養素組成：極低碳水化合物、高脂肪、適量蛋白質之飲食模式，促使人體自「葡萄糖供能模式」轉換為「脂肪酸與酮體供能模式」，誘導產生營養性酮症（Nutritional Ketosis）。
2. 荷爾蒙調節軸變動：低碳水化合物攝取使血糖下降，促使胰島素（Insulin）分泌大幅減少、升糖素（Glucagon）分泌上升，使體內 Insulin / Glucagon 莫耳比值降低。
3. 脂肪動員與 $\beta$-氧化（$\beta$-oxidation）：低胰島素狀態解除對脂肪組織「荷爾蒙敏感性脂肪酶（Hormone-Sensitive Lipase, HSL）」之抑制，釋出大量游離脂肪酸（Free Fatty Acids, FFA）進入肝臟，經由肉鹼穿梭（Carnitine shuttle）進入粒線體進行高通量 $\beta$-氧化，產生巨量乙醯輔酶 A（$\text{Acetyl-CoA}$）、$\text{NADH}$ 與 $\text{ATP}$。
4. 草醯乙酸（Oxaloacetate, OAA）相對匱乏與代謝分流：

• 肝臟因應高升糖素刺激，極力啟動糖質新生（Gluconeogenesis），大量消耗粒線體內的草醯乙酸（OAA）。
• 高通量 $\beta$-氧化產生的過量 $\text{NADH}$ 使粒線體內 $\text{NADH} / \text{NAD}^+$ 比值劇增，促使蘋果酸去氫酶（Malate dehydrogenase）逆反應加速，將 $\text{OAA}$ 還原為蘋果酸（$\text{Malate}$）： $\text{Oxaloacetate} + \text{NADH} + \text{H}^+ \rightleftharpoons \text{Malate} + \text{NAD}^+$
• 游離 $\text{OAA}$ 濃度極度匱乏，使得 $\text{Acetyl-CoA}$ 無法與 $\text{OAA}$ 縮合形成檸檬酸以順暢進入三羧酸循環（TCA cycle），形成代謝瓶頸。

5. 粒線體酮體生成途徑（Ketogenesis）：肝臟粒線體利用溢流的 $\text{Acetyl-CoA}$ 合成三種酮體：乙醯乙酸（$\text{Acetoacetate}$）、$\beta$-羥基丁酸（$\beta\text{-Hydroxybutyrate}$）及丙酮（$\text{Acetone}$）。其中**粒線體 HMG-CoA 合成酶（Mitochondrial HMG-CoA synthase）**為速率限制酵素。
6. 肝外組織酮體利用（Ketolysis）：酮體可穿透血腦屏障，作為大腦、心肌與骨骼肌之高效替代能源；肝臟因缺乏**$\beta$-酮醯基輔酶 A 轉移酶（$\beta\text{-Ketoacyl-CoA transferase / Thiophorase}$）**，無法利用自身製造之酮體。

---

解題方法

本題配分為 15 分之申論題，作答結構應採取「定義與歷史沿革 $\rightarrow$ 內分泌與器官間代謝串聯 $\rightarrow$ 肝臟細胞內生化酵素反應 $\rightarrow$ 肝外周邊組織能量利用」之層次開展：

1. 破題定義（約占 3 分）： 精確定義生酮飲食的巨量營養素熱量佔比（碳水化合物 $<5\sim 10\%$、脂肪 $70\sim 80\%$、蛋白質 $15\sim 20\%$），區分其與一般飢餓狀態之生理差異，強調「以脂質代替葡萄糖」為主要能量受質。
2. 內分泌與前驅步驟調控（約占 4 分）： 詳細推導從口服攝取變更到脂肪酸進入粒線體的連鎖反應：低血糖 $\rightarrow$ $\text{Insulin} \downarrow / \text{Glucagon} \uparrow$ $\rightarrow$ 脂肪細胞 HSL 活化 $\rightarrow$ 游離脂肪酸釋出 $\rightarrow$ 肝臟攝取脂肪酸並進行 $\beta$-氧化 $\rightarrow$ 產生巨量 $\text{Acetyl-CoA}$ 與 $\text{NADH}$。
3. 生酮反應之生化機制推導（核心得分點，約占 5 分）：

• 清楚闡釋「為什麼 $\text{Acetyl-CoA}$ 必須走向生酮？」：說明 TCA cycle 之入口阻斷機制（糖質新生抽走 OAA 加上高 $\text{NADH}/\text{NAD}^+$ 比值壓制 OAA 生成）。
• 寫出肝臟粒線體基質內生酮作用的四大化學反應與酵素名稱，特別標註速率限制步驟。

4. 生理代償與利用（約占 3 分）： 說明酮體運送至肝外組織（骨骼肌、心肌、大腦）進行再轉化為 $\text{Acetyl-CoA}$ 產生能量的過程，並點明「肝臟無法利用酮體」之酵素學關鍵（缺少 Thiophorase）。

---

選項分析

本題為申論題，並無單選或複選選項。閱卷給分之關鍵查核指標與考生常混淆之觀念辨析如下：

• 辨析一：營養性酮症（Nutritional Ketosis） vs. 糖尿病酮酸中毒（Diabetic Ketoacidosis, DKA）
• 正確理解：生酮飲食引發之血中酮體濃度通常介於 $0.5\sim 3.0\ \text{mmol/L}$，體內仍有微量基礎胰島素分泌以抑制過度脂肪分解，血液 pH 值維持在正常生理範圍（$7.35\sim 7.45$）；第一型糖尿病之 DKA 則是體內完全缺乏胰島素，引發失控之脂肪分解，血酮飆升至 $>10\sim 25\ \text{mmol/L}$，導致嚴重陰離子間隙代謝性酸中毒，兩者不可混為一談。
• 辨析二：高脂低碳 vs. 高蛋白飲食
• 正確理解：生酮飲食必須限制蛋白質為「適量（Moderate）」，不能盲目提高蛋白質。若攝取過量蛋白質，生糖型胺基酸（Glucogenic amino acids）會透過糖質新生途徑合成葡萄糖，進而刺激胰島素分泌並抑制生酮作用，使身體跳脫生酮狀態。
• 辨析三：粒線體 HMG-CoA 合成酶 vs. 細胞質 HMG-CoA 合成酶
• 正確理解：生酮作用之關鍵酵素為粒線體同功異構酶（Mitochondrial isozyme）；而細胞質中的 HMG-CoA 合成酶與 HMG-CoA 還原酶（HMG-CoA reductase）則是參與膽固醇生合成（Cholesterol biosynthesis），兩者胞器分室不同，不可混淆。

---

解題技巧

1. 五步連鎖記憶骨架： $\text{低醣} \rightarrow \text{降胰升升糖（Insulin}\downarrow\text{ / Glucagon}\uparrow\text{）} \rightarrow \text{脂肪分解與 }\beta\text{-氧化} \rightarrow \text{OAA 耗竭堵塞 TCA} \rightarrow \text{生酮溢流}$ 牢記此邏輯鏈，即可完整涵蓋機制題的各階段生理與生化變化。
2. 必背三大酮體分子式與反應關係：

• 乙醯乙酸（Acetoacetate）：首個生成的游離酮體。
• $\beta$-羥基丁酸（$\beta$-Hydroxybutyrate）：主循環形式，由乙醯乙酸經由 $\beta$-羥基丁酸去氫酶受 $\text{NADH}$ 還原而來（化學上雖無酮基，但臨床與生化通稱酮體）。
• 丙酮（Acetone）：乙醯乙酸自發性或非酵素性脫羧的產物，具揮發性，由呼吸排出。

3. 高分亮點關鍵字： 在卷面上主動寫出 「Mitochondrial HMG-CoA synthase 是生酮限速酶」 與 「肝臟缺乏 Thiophorase（$\beta$-ketoacyl-CoA transferase）因而不能利用酮體」，是閱卷委員評定考生具備扎實醫學生物化學底蘊的重要指標。

---

【答案】

一、何謂「生酮飲食」（Definition of Ketogenic Diet）

**生酮飲食（Ketogenic Diet, KD）**是一種以「極低碳水化合物、高脂肪、適量蛋白質」為特徵的極端飲食配比模式。

1. 熱量與巨量營養素比例：

• 脂肪（Fat）：占每日總熱量攝取的 $70\%\sim 80\%$。
• 蛋白質（Protein）：占總熱量 $15\%\sim 20\%$（維持氮平衡，避免過量轉化為葡萄糖）。
• 碳水化合物（Carbohydrate）：嚴格限制於總熱量 $5\%\sim 10\%$（通常每日攝取量小於 $20\sim 50\ \text{g}$）。

2. 生理目的：

核心觀念

1. 等電點（Isoelectric Point, pI）：兩性分子（如胺基酸、胜肽或蛋白質）在特定 pH 值的水溶液中，分子結構上正電荷與負電荷數量相等，整體淨電荷（net charge）為零的狀態。
2. 等電聚焦電泳（Isoelectric Focusing, IEF）：利用膠體內建立的穩定且連續之 pH 梯度，在電場驅動下，使兩性分子依其固有等電點（pI）分離的高解析度電泳技術。
3. 多質子胺基酸之解離平衡與 pI 計算：胺基酸隨環境 pH 由低至高逐漸解離去質子。當淨電荷為零（兩性離子形式，Zwitterion）時，其等電點即為夾住該中性分子形態兩側之 $pK_a$ 的算術平均值。

---

解題方法

(一) 等電點（isoelectric point, pI）之定義與特徵

1. 定義： 等電點是指兩性電解質（如胺基酸或蛋白質）在水溶液中，其分子結構解離達到動態平衡，使得所帶的正電荷總數等於負電荷總數，即**分子淨電荷等於零（Net charge = 0）時的溶液 pH 值，記作 $pI$。此時分子主要以兩性離子（Zwitterion）**形態存在。
2. 物理化學特徵：

• 電泳行為：置於外加電場中時，因淨電荷為零，分子不會朝正極（陽極）或負極（陰極）定向泳動（遷移速率 $v = 0$）。
• 溶解度特性：在等電點時，分子間的靜電排斥力最小，分子容易藉由疏水性交互作用聚集，因此蛋白質在 $pI$ 處的溶解度通常為最低（易產生沈澱）。

---

(二) 等電聚焦電泳法（isoelectric focusing, IEF）之原理與機制

1. 系統組成： 在電泳凝膠（多為聚丙烯醯胺凝膠）中加入載體兩性電解質（Carrier ampholytes）或使用共價鍵結的固定化 pH 梯度膠片（IPG strips），通電後在凝膠內由陽極（低 pH，酸性端）至陰極（高 pH，鹼性端）建立穩定且連續的線性 pH 梯度。
2. 聚焦分離機制：

• 當樣品（蛋白質混合物）加入電場中時：
• 若蛋白質處於 $\text{pH} < pI$ 區域，分子帶正電荷，受電場排斥往陰極（高 pH 方向）泳動。
• 若蛋白質處於 $\text{pH} > pI$ 區域，分子帶負電荷，受電場排斥往陽極（低 pH 方向）泳動。
• 聚焦（Focusing）效應：蛋白質泳動至其環境 $\text{pH} = pI$ 的位置時，淨電荷轉為零，電泳遷移力消失而停止移動。若分子因分子擴散作用偏移該位置，會立刻重新帶電並被電場推回 $pI$ 位置，最終在特定 pH 處聚焦成極狹窄的條帶。

3. 應用： 具有極高解析度（可分辨 $\Delta pI < 0.01$ 的異構物），常用於蛋白質等電點測定及雙向凝膠電泳（2D-PAGE）的第一向分離。

---

(三) Lysine（賴胺酸）之等電點計算

1. 官能基與 $pK_a$ 對應： Lysine 屬於鹼性胺基酸（二元鹼一元酸），具有三個可游離基團：

• $\alpha\text{-羧基} \; (\alpha\text{-COOH})：pK_1 = 2.2$
• $\alpha\text{-胺基} \; (\alpha\text{-NH}_3^+)：pK_2 = 9.0$
• 側鏈 $\varepsilon\text{-胺基} \; (\varepsilon\text{-NH}_3^+)：pK_R = 10.5$

2. 各 pH 區間的解離狀態與淨電荷推導： 隨環境 pH 上升，質子依酸性強弱（$pK_a$ 由小到大）依序解離：

核心觀念

1. CRISPR/Cas9 系統本質：源自原核生物（細菌與古菌）抵禦外來噬菌體及質體 DNA 入侵的「後天適應性免疫系統（Adaptive Immune System）」，經人工改造後成為精準的高效「基因體編輯（Genome Editing）」工具。
2. 分子組成：包含核酸內切酶（Cas9 核酸酶）與導引序列（單一導引 RNA，即 sgRNA）。
3. 靶向與剪切條件：依賴 sgRNA 與目標 DNA 的互補鹼基配對，以及 Cas9 專一性辨識的「原間隔序列相鄰基序（Protospacer Adjacent Motif, PAM）」。
4. DNA 雙鏈斷裂（DSB）與修復機制：剪切後誘發宿主細胞的非同源性末端接合（NHEJ）或同源重組修復（HDR），進而達到基因剔除（Knockout）或基因嵌入／置換（Knockin）。

---

解題方法

本題為標準 10 分的申論簡答題，切入點應採「雙軌分項破題法」：

1. 第一部分：定義界定（何謂 CRISPR/Cas9）：說明其全名、生物起源（細菌抗病毒防禦）、人工改造成二元系統（Cas9 + sgRNA）的本質及其在現代分子生物學中的定位（可程式化 RNA 導引核酸內切酶）。
2. 第二部分：運作機制（原理說明）：按照分子作用的自然時序分成四個連續步驟說明——「導引定位（Targeting）」$\rightarrow$「PAM 辨識與解旋（Binding）」$\rightarrow$「雙鏈剪切（Cleavage）」$\rightarrow$「宿主修復（Repair）」。
3. 論述邏輯：特別強調「Cas9 僅負責製造斷裂（DSB），最終的編輯結果取決於宿主細胞的 DNA 修復途徑」，展示精確的分子生物學因果層次。

---

選項分析

本題為申論問答題（非選擇題），無選項可供比對分析。配分應對策略如下：

• 第一問「何謂 CRISPR/Cas9 技術」（約 4 分）：必須包含全名縮寫來源、自然界防禦本質、工程化改造成「二元分子剪刀」之定義。
• 第二問「技術原理」（約 6 分）：必須完整答出 sgRNA 互補辨識、PAM 序列角色、Cas9 剪切產生 DSB，以及後續兩種修復途徑（NHEJ 與 HDR）的生物學結果。缺漏 PAM 或修復途徑將導致大幅失分。

---

解題技巧

1. 得分關鍵名詞（Key Terms）：

• CRISPR：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（常間隔叢集短回文重複序列）。
• Cas9：CRISPR-associated protein 9（核酸內切酶）。
• sgRNA：Single guide RNA（融合天然 crRNA 與 tracrRNA 的工程化單鏈引導 RNA）。
• PAM：Protospacer Adjacent Motif（原間隔序列相鄰基序，最常見 S. pyogenes Cas9 辨識序列為 5'-NGG-3'）。
• DSB：Double-Strand Break（DNA 雙鏈斷裂）。
• NHEJ 與 HDR：非同源性末端接合（導致失活突變）與同源引導修復（精確基因修正）。

2. 常見失分陷阱：

• 陷阱一：誤以為 Cas9 會「自動修改或合成基因」。Cas9 本身只是核酸內切酶，基因編輯的突變結果是由細胞本身的 DNA 修復酵素系統完成的。
• 陷阱二：漏寫「PAM 序列」。若未提及 Cas9 必須先辨識目標 DNA 鏈上的 PAM 序列才能使雙鏈解旋配對，閱卷老師會判定考生對機制理解不夠深入。
• 陷阱三：未區分天然系統（三元：Cas9 + crRNA + tracrRNA）與人工編輯系統（二元：Cas9 + sgRNA）。寫出人工 sgRNA 的簡化設計是高分關鍵。

---

【答案】

核心觀念

本題考查絲胺酸蛋白酶家族（Serine Proteases）的經典催化機制、受質專一性結構基礎及蛋白質工程應用，核心觀念包含：

1. 催化三聯體（Catalytic Triad）：絲胺酸蛋白酶（如 Chymotrypsin、Trypsin、Elastase）催化活性的共同構造，由 $\text{Asp}^{102}$、$\text{His}^{57}$、$\text{Ser}^{195}$ 組成「電荷中繼系統（Charge-relay system）」。
2. 受質結合口袋（S1 Specificity Pocket）：位於活性區附近的凹陷結構，其形狀、大小與袋底殘基電荷決定了酵素對受質胜肽鍵前一位（P1 位置）側鏈的專一性辨識。
3. 蛋白質工程與定點突變（Site-directed Mutagenesis）：藉由重組 DNA 技術在基因層面精確置換胺基酸密碼子，改變酵素結構以改造其受質專一性或催化特性。

---

解題方法

(一) chymotrypsin 的催化區胺基酸組成

• 切入點：絲胺酸蛋白酶的催化三聯體是固定的演化保守結構。
• 解析：催化區的核心由三個胺基酸殘基以氫鍵緊密連結，依序為：

1. 天門冬胺酸（Aspartic acid / $\text{Asp}^{102}$）：穩定 His 的質子化狀態並微調其 $pK_a$。
2. 組胺酸（Histidine / $\text{His}^{57}$）：扮演廣義酸鹼催化角色，奪取 Ser 上的質子形成強親核基團，隨後提供質子給離去基團。
3. 絲胺酸（Serine / $\text{Ser}^{195}$）：羥基（$-\text{OH}$）受 His 活化後形成強烈親核劑烷氧負離子（$\text{alkoxide ion}$），攻擊受質的羰基碳（Carbonyl carbon）形成共價醯基-酵素中間體（Acyl-enzyme intermediate）。

(二) 凹陷口袋的作用

• 切入點：酵素「結構決定功能」原則，區分「催化活性區」與「受質辨識區」。
• 解析：

1. 主要作用：該凹陷口袋為 S1 受質專一性結合口袋（S1 specificity pocket），專司容納並辨識受質胜肽鏈切割位點 N 端鄰近（P1 residue）的胺基酸側鏈，賦予酵素高度的受質專一性（Substrate specificity）。
2. 兩者比對：

• Trypsin：袋底為帶負電的 $\text{Asp}^{189}$，能透過靜電引力（鹽橋）特異性吸附受質上帶正電荷的長鏈鹼性胺基酸側鏈（離胺酸 $\text{Lys}$、精胺酸 $\text{Arg}$）。
• Chymotrypsin：袋底為中性親水性的 $\text{Ser}^{190}$，且口袋深、寬廣且富含疏水性環境，專門容納龐大的芳香族側鏈（苯丙胺酸 $\text{Phe}$、酪胺酸 $\text{Tyr}$、色胺酸 $\text{Trp}$），藉由疏水交互作用定位受質。

(三) 將 Trypsin 活性改為 chymotrypsin 的進行方式

• 切入點：以分子生物學的基因工程技術（定點突變）置換決定專一性的關鍵胺基酸與周邊環狀結構。
• 步驟推導：

1. 基因層次——定點突變（Site-directed mutagenesis）：

• 選殖含有 Trypsin 原生基因之質體（cDNA）。
• 設計含有特定錯配鹼基的引子（Primers），將 Trypsin S1 口袋袋底的 $\text{Asp}^{189}$ 密碼子突變為編碼 $\text{Ser}$ 的密碼子（即進行 $\text{Asp189Ser}$ 置換），消除袋底負電荷，以符合 Chymotrypsin 袋底 $\text{Ser}^{190}$ 的特性。

2. 結構層次——周邊環狀結構（Surface Loops）置換：

• 根據蛋白質工程經典研究，僅突變單一袋底殘基（$\text{Asp189Ser}$）只能破壞 Trypsin 對鹼性殘基的活性，無法直接展現高效的 Chymotrypsin 活性。
• 必須進一步重組或置換 S1 口袋周圍決定進出口幾何構型的兩個表面環狀區段（Surface loops，特別是 loop 185–188 與 loop 221–225），將其改造成 Chymotrypsin 的相應胺基酸序列，使口袋更加開闊與疏水，方能完整容納龐大的芳香族環。

3. 表現與活性驗證：

• 將重組質體構築入表現宿主（如 E. coli 或酵母菌）進行蛋白質表現與純化。

核心觀念

1. 轉換數（Turnover Number, t.o.n.）的生化定義： 酵素的轉換數又稱催化常數（catalytic constant），國際通用符號為 $k_{\text{cat}}$。其定義為：當酵素完全被受質飽和（即 $[S] \gg K_m$，所有酵素均以酵素-受質複合物 $[ES]$ 形式存在）時，單位時間內單一酵素分子（或單一活性中心）催化受質轉化為產物的最大分子數。
2. 米氏動力學（Michaelis-Menten Kinetics）核心公式： 在飽和狀態下，反應達到最大初速率（$V_{\max}$）： $V_{\max} = k_{\text{cat}} [E]_t$ 移項即可得到計算公式： $k_{\text{cat}} = \frac{V_{\max}}{[E]_t}$

• $V_{\max}$：最大反應初速率（單位通常為 $\mu\text{M} \cdot \text{s}^{-1}$ 或 $\text{M} \cdot \text{s}^{-1}$）。
• $[E]_t$：反應系統中的總酵素濃度（單位為 $\mu\text{M}$ 或 $\text{M}$）。
• $k_{\text{cat}}$（t.o.n.）：單位為時間的倒數（$\text{s}^{-1}$ 或 $\text{min}^{-1}$）。

---

解題方法

要精確計算一個酵素的 turn over number，需依序完成以下三個關鍵步驟：

1. 步驟一：測定並計算最大反應速率（$V_{\max}$）

• 固定酵素總濃度 $[E]_t$，加入一系列不同濃度的受質 $[S]$，測定各濃度下的初始反應速率（$v_0$）。
• 繪製米氏動力學曲線，或透過 Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法（Double-reciprocal plot）： $\frac{1}{v_0} = \frac{K_m}{V_{\max}} \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}}$
• 由圖形直線的 $y$ 軸截距求得 $\frac{1}{V_{\max}}$，進而計算出 $V_{\max}$。

2. 步驟二：測定反應系統中的酵素總濃度（$[E]_t$）

• 透過純化酵素樣品，利用紫外光吸光值（$A_{280}$）搭配消光係數（$\varepsilon$），或使用蛋白質定量法（如 Bradford assay、BCA assay）測定總蛋白質量濃度（$\text{g/L}$ 或 $\text{mg/mL}$）。
• 結合該酵素的已知分子量（$\text{MW}$，單位 $\text{g/mol}$），換算出酵素的莫耳濃度 $[E]_t$： $[E]_t = \frac{\text{質量濃度}}{\text{分子量}}$

3. 步驟三：代入公式計算 $k_{\text{cat}}$

• 將求得的 $V_{\max}$ 與 $[E]_t$ 代入定義式： $k_{\text{cat}} = \frac{V_{\max}}{[E]_t}$