110 高普考高考二級 水產利用 食品分析與檢驗研究 考古題詳解

核心觀念

本題重點是說明 LC-MS/MS 如何先以液相層析分離複雜食品基質中的成分，再以串聯質譜的母離子、產物離子及離子強度確認並定量目標藥物。魚肉中的四環黴素殘留，須經萃取與淨化後，以正離子電灑游離及多重反應偵測（MRM）分析。

以命題當年（民國 110 年）法規為準；當時公告的「食品中動物用藥殘留量檢驗方法－四環黴素類抗生素之檢驗」，適用畜禽及水產品，採 LC-MS/MS 測定。考題稱「四環黴素」，實際檢驗方法涵蓋四環黴素類多項藥物及其差向異構物。

LC-MS/MS 測定原理

1. 液相層析分離：檢液由流動相帶入層析管柱。各成分因與固定相及流動相作用程度不同，產生不同滯留時間，藉此將四環黴素與基質干擾物分離。
2. 離子化：液相流出物進入電灑離子化源（ESI）。在本方法中採正離子模式（ESI+），使四環黴素形成帶電的前驅離子。
3. 串聯質譜分析：第一級質譜選出特定質荷比（$m/z$）的前驅離子；碰撞室以惰性氣體使其碰撞碎裂；第二級質譜再選擇特定產物離子。特定的「前驅離子 $\rightarrow$ 產物離子」即為離子對。
4. 定性與定量：以滯留時間及兩組 MRM 離子對的相對離子強度確認身分；以定量離子對波峰面積，配合檢量線計算濃度。MRM 同時監測多組特定離子對，可提高選擇性並降低基質干擾。

魚肉中四環黴素的檢測流程

一、檢體萃取

將魚肉細切、均質，精確稱取約 $5\ \mathrm{g}$ 置於離心管。加入 MacIlvaine 緩衝溶液 $15\ \mathrm{mL}$，旋渦混合 1 分鐘、振盪 5 分鐘，以 $4000\ \mathrm{rpm}$ 離心 10 分鐘，取上清液。殘渣再以同量緩衝液重複萃取一次，合併上清液。

加入正己烷 $15\ \mathrm{mL}$，混合、振盪後離心，收集下層液；再重複正己烷處理兩次。下層液經濾紙過濾，供後續淨化。緩衝液用來萃取四環黴素，正己烷則移除脂質等非極性成分。

二、固相萃取淨化

將萃取液注入預先以甲醇及水潤洗的 Oasis HLB 固相萃取匣，棄去流出液。以 5% 甲醇溶液洗去部分干擾物，再以甲醇沖提出四環黴素。沖提液於 $40^\circ\mathrm{C}$ 水浴中以氮氣吹乾，殘留物以 20% 乙腈溶液溶解並定容至 $1\ \mathrm{mL}$，經濾膜過濾後作為檢液。

三、LC-MS/MS 分析及定性

使用 C18 層析管柱，以甲酸水溶液及甲酸乙腈溶液作梯度移動相；流速為 $0.2\ \mathrm{mL/min}$，注入量為 $5\ \mu\mathrm{L}$。質譜採 ESI+ 與 MRM 模式。

四環黴素的離子對為：

核心觀念

本題考查一氧化碳（carbon monoxide, CO）處理魚肉後造成的色澤變化，以及食藥署公告的魚肉中一氧化碳檢驗方法。依命題當年（民國 110 年）法規與公告方法作答：一氧化碳不是魚肉可任意使用的食品添加物，業者以其處理魚肉，藉外觀增紅掩飾魚肉原有色澤，涉及違法使用食品添加物的管理規範。

一氧化碳與魚肉中的肌紅蛋白結合，生成羧基肌紅蛋白，使魚肉呈現鮮紅色。這種色澤效果可能延續一段時間，讓消費者難以單靠顏色判斷魚肉品質；但一氧化碳不會使魚肉恢復新鮮，也不能阻止腐敗。

解題方法與公告檢測方法

作答時依序交代「添加目的、作用機轉、分析方法、結果判讀」，並區分包裝袋篩檢與魚肉檢驗。公告方法為食藥署「魚肉中一氧化碳之檢驗方法」，採氣相層析法（GC），搭配甲烷化裝置與火焰離子檢出器（FID）。

一、添加目的

一氧化碳可讓魚肉呈現較鮮紅、紅潤的色澤，改善商品賣相。業者藉此掩蓋魚肉原本的褪色或變色，容易使消費者將鮮紅外觀誤認為新鮮。

二、作用機轉

魚肉中的肌紅蛋白（myoglobin）含有血基質鐵。一氧化碳與肌紅蛋白結合形成羧基肌紅蛋白（carboxymyoglobin），其紅色較穩定、外觀鮮明。

可用下列反應概念表示：

其中 $\mathrm{Mb}$ 為肌紅蛋白，$\mathrm{MbCO}$ 為羧基肌紅蛋白。羧基肌紅蛋白形成後，魚肉表面看起來紅潤；這是色素與氣體結合造成的外觀變化，不能據此認定魚肉仍新鮮。

三、公告檢測方法

1. **包裝袋篩檢：**對真空包裝魚肉，可先抽取袋內氣體，以 GC 分析一氧化碳。此步驟供篩檢使用；袋內氣體超過方法所列篩檢門檻時，再取魚肉檢驗。
2. **魚肉檢驗：**魚肉以冷卻冰水均質，離心取上清液；

核心觀念

本題比較兩種常用於水產品評估的含氮物質：

• **揮發性鹽基態氮（VBN）**是魚肉中揮發性鹼性含氮物質的總量指標，主要包括氨、三甲胺（TMA）及二甲胺（DMA）。
• **組織胺（histamine）**是由游離組胺酸經細菌脫羧作用形成的生物胺，特別常見於鯖科、鮪魚等組胺酸含量較高的魚種。

兩者雖都會在魚肉品質變差時受到關注，意義並不相同：VBN偏向反映較廣泛的腐敗變化；組織胺則是特定細菌作用的產物，也是可能造成組織胺中毒的危害物質。

解題方法與作答要點

一、揮發性鹽基態氮（VBN）

(1) 生成原因

魚體死後，組織自溶酵素及微生物共同分解蛋白質、胜肽及其他含氮物質，逐漸產生鹼性、具揮發性的含氮化合物，例如氨、TMA及DMA。

海水魚肌肉中的氧化三甲胺（TMAO）可在魚體死後被細菌或酵素還原，形成TMA；蛋白質及胺基酸分解則可形成氨等物質。這些揮發性鹼性物質累積後，使VBN上升。

(2) 檢測方法

常見方法為 Conway 微量擴散法，也可用蒸氣蒸餾法。

Conway法的原理與步驟如下：

1. 將魚肉均質，以三氯乙酸（TCA）萃取並沉澱蛋白質，取得萃取液。
2. 將萃取液置於Conway擴散器外室；內室加入硼酸吸收液及指示劑。
3. 外室加入碳酸鉀等鹼性溶液，使VBN中的揮發性鹼釋出並擴散至內室。
4. 以標準酸滴定內室吸收的鹼性含氮物質，依滴定量換算VBN含量，通常以每100克魚肉中的氮量表示。

作答時應點出「鹼化釋出揮發性鹼、硼酸吸收、標準酸滴定」這條分析原理。

(3) 含量與新鮮度的關係

一般而言，魚肉腐敗程度增加時，VBN含量會上升，因此可用作新鮮度或腐敗程度的指標。但VBN反映的是多種揮發性鹼性含氮物質的總量，受魚種、季節、肌肉部位與保存條件影響；其變化不一定在腐敗初期就十分明顯，也不能單靠VBN判定所有魚種的新鮮度。

二、組織胺（histamine）

(1) 生成原因

魚肉中的游離組胺酸（histidine）經產組織胺細菌所產生的**組胺酸脫羧酶（histidine decarboxylase）**作用，脫去羧基形成組織胺：

核心觀念

本題考查食品分析與檢驗的基本術語：定量方法的能力界限、測量結果的偏差，以及兩種常見儀器分析技術的原理與用途。作答時應先界定名詞，再說明測量訊號或誤差的來源，並指出適用對象。

解題方法與名詞說明

(1) 定量極限（limit of quantification, LOQ）

定量極限是分析方法在可接受的精密度與正確度下，能夠定量測得分析物的最低含量或濃度。低於此界限時，方法可能仍能辨識分析物存在，但定量結果的誤差過大，不能視為可靠的定量值。

在訊號雜訊比法中，常以分析物訊號與背景雜訊比約為 10 作為估算依據：

其中 $\sigma$ 為空白訊號或低濃度樣品訊號的標準差，$S$ 為檢量線斜率。此式是估算方式；實際 LOQ 仍須依方法要求，以低濃度樣品確認其精密度與正確度是否可接受。

(2) 絕對偏差（absolute deviation）

絕對偏差是單一測量值與指定參考值之差的絕對值，表示測量結果偏離參考值的大小，不保留偏離方向。

若測量值為 $x_i$，參考值為 $x_{\mathrm{ref}}$，則：

參考值可為真值、標準值，或在特定統計分析中採用的平均值。若以一組測量值的平均數 $\bar{x}$ 為參考，則單次測量的絕對偏差為 $\left|x_i-\bar{x}\right|$。它不同於相對偏差；相對偏差會再以參考值為分母，通常以百分比表示。

(3) 感應耦合電漿放射光譜儀（inductively coupled plasma optical emission spectrometer, ICP-OES）