112 高普考高考二級 水產利用 高等食品微生物學 考古題詳解

核心觀念

「存活但無法培養的細菌」（viable but nonculturable bacteria, VBNC）是指細菌在低溫、缺乏營養、鹽度或酸鹼值改變、氧化壓力、消毒劑等不利環境下，失去在一般常規培養基上形成菌落的能力，但仍保有一定生理活性或存活特徵的狀態。它不是單純的死亡，也不等同於一般可培養菌的休眠；部分菌種在環境條件改善後，能恢復生長並重新形成菌落，此現象稱為「復甦」（resuscitation）。

解題方法

作答可依序說明三件事：先界定 VBNC 與常規培養陰性之間的差別，再整理其生理及環境特性，最後說明如何用培養法搭配非培養法進行檢驗與鑑定。關鍵是不能只以「平板無菌落」判定細菌死亡，因為 VBNC 細胞的核心特徵正是常規培養陰性，但仍保有存活跡象。

VBNC 的主要特性

1. 常規培養無法形成菌落：在一般培養基及培養條件下，細胞不能增殖至可見菌落，因此以菌落形成單位（CFU）計數時會被低估或檢出為陰性。
2. 仍保有部分存活或生理活性：細胞膜完整性、酵素活性、呼吸作用、ATP 含量或基因轉錄等指標，可能仍顯示細胞具有活性；但不同指標代表的生理狀態並不完全相同。
3. 形態與代謝常有改變：細胞可能縮小、形態改變，代謝速率及營養需求降低，並提高對環境壓力的耐受性。
4. 可由環境壓力誘發：低溫、飢餓、滲透壓或鹽度變化、酸鹼值改變、氧化壓力及消毒處理等，均可能促使部分細菌進入 VBNC 狀態。
5. 部分細胞可復甦：環境改善、補充適當營養或加入特定復甦因子後，部分 VBNC 細胞可恢復培養性；復甦與細菌種類及處理條件有關。
6. 具食品安全與檢驗意義：病原菌即使未能在例行培養中形成菌落，仍可能保有一定活性；因此單靠常規培養陰性，不能充分排除其存在。

檢驗與鑑定方法

1. 常規培養與復甦培養

• 先以選擇性或非選擇性培養基進行常規分離，記錄是否形成菌落及 CFU。
• 對培養陰性的樣品，再採用較溫和的非選擇性培養、調整溫度或培養時間、補充適當營養，或使用已知復甦因子與復甦條件後重新培養。
• 若原本無菌落的樣品在復甦處理後出現目標菌生長，支持其中存在可復甦細胞；

核心觀念

ATP 光度測定法是以生物發光反應測量樣品中的三磷酸腺苷（ATP），再用發光強度快速評估器具表面的衛生狀況。ATP 存在於活的微生物細胞，也存在於牛奶、體細胞及其他有機殘留物中，因此這項方法測得的是樣品中的總 ATP 訊號，不是直接測得特定細菌數。

反應使用螢火蟲的螢光素酶（luciferase）及螢光素（luciferin），並需有氧氣與鎂離子參與：

儀器以光度計或螢光計讀取光訊號，常以相對光單位（relative light units, RLU）表示。在試劑與儀器條件固定時，ATP 越多，發光訊號通常越強。RLU 是儀器的相對讀值；要換算成 ATP 含量，須以標準品校正。

解題方法

作答時抓住「ATP 轉成光訊號，再以光訊號快速判斷清潔狀況」這條主線，並說明此法的應用邊界：它適合快速監測器具表面是否留有生物性或有機性污染，不能取代培養法來判定菌落數或病原菌種類。

典型操作流程如下：

1. 以拭子擦拭乳品生產器具的指定表面，例如擠乳器、乳管接頭、集乳槽或乳槽內壁。
2. 將拭子上的 ATP 萃取至反應液，再加入螢光素與螢光素酶試劑。
3. 使用光度計讀取發光值，以事先設定的限值、清潔前後差異或趨勢資料判斷清潔效果。
4. 若讀值偏高，可重新清洗並複測；

核心觀念

即時 PCR（real-time PCR；常以 qPCR 表示）是在 PCR 擴增過程中，逐循環偵測螢光訊號，追蹤目標核酸產物增加的技術。反應結束後才看有無產物的傳統 PCR，則稱終點 PCR。

題目寫「RT-PCR」時須留意縮寫可能有歧義：它也常指反轉錄 PCR（reverse transcription PCR）。若檢測 RNA 病毒，須先以反轉錄酶將 RNA 轉成互補 DNA（cDNA），再進行即時 PCR，稱即時反轉錄 PCR（real-time RT-PCR 或 qRT-PCR）。即時偵測的常見原理，則是以雙股 DNA 結合染劑或序列專一性螢光探針產生訊號。

即時 PCR 可利用循環閾值（$C_t$ 或 $C_q$）作半定量或定量分析：螢光訊號達到設定閾值時所需的循環數愈少，通常代表起始目標核酸量愈多。定量時可用標準曲線將 $C_t$ 換算為目標核酸量；若要推算食品中的活菌數，仍須考量前處理、增菌、核酸萃取效率，以及死菌核酸也可能被偵測等因素。

解題方法

作答時選取兩種具代表性的螢光偵測機制，分別說明「訊號如何產生、專一性如何、適用情境與產業用途」。最常見的組合是 SYBR Green 染劑法與 TaqMan 探針法。

一、SYBR Green 雙股 DNA 結合染劑法

SYBR Green I 與雙股 DNA 結合後會產生較強螢光；游離時螢光較弱。PCR 每循環產生更多雙股 DNA，染劑結合量增加，螢光訊號隨之上升。儀器在每個循環讀取訊號，即可繪製擴增曲線並取得 $C_t$。

此法不需另外設計專一性探針，成本較低、設計快速，可用於常規檢測及大量樣本篩檢。但染劑會與任何雙股 DNA 結合，因此非專一性擴增產物或引子二聚體也可能產生訊號。實務上可搭配融解曲線分析，檢查產物的融解溫度是否符合預期；必要時再以電泳或其他方法確認。

**產業應用：**食品與水產食品微生物檢驗可用於篩檢沙門氏菌、李斯特菌等病原菌的目標基因；也可用於魚介類加工環境、養殖水體的微生物監測，以及菌體或特定微生物基因的相對定量。對複雜食品基質或要求高度專一性的確認檢驗，須特別留意非專一性訊號。

二、TaqMan 水解探針法

核心觀念

本題考查食源性病原菌李斯特單胞菌的辨識，以及其在食品中的存活特性、傳播途徑、臨床表現與預防原則。作答時應先寫出致病菌的完整學名，再依「菌種特性—感染來源—症狀—高危險族群—預防」逐項說明。

本題為食品微生物學題目，無須援引特定法條或計算公式。

解題方法

以病原菌為中心，分成「菌本身的特性」與「人如何感染及如何預防」兩部分：

1. 先交代致病菌為 Listeria monocytogenes，並列出可支持其食品危害判斷的生理特性。
2. 說明菌從環境進入食物、再經食物進入人體的主要途徑。
3. 區分一般人的腸胃症狀與高危險族群可能發生的侵襲性感染。
4. 預防措施同時涵蓋食品處理、冷藏管理、避免交叉污染與高危險族群的飲食選擇。

參考詳解

一、學名

李斯特單胞菌的學名為 Listeria monocytogenes，其所引起的疾病稱為李斯特菌症（listeriosis）。

二、菌種特性

L. monocytogenes 為革蘭氏陽性、短桿狀、兼性厭氧菌，不形成芽孢，具有運動性；在適宜條件下可呈現翻滾或傘狀運動。此菌能在多種環境中存活，常見於土壤、水、腐敗植物及動物腸道或糞便。

食品衛生上尤其要注意下列特性：

• 可在冷藏溫度下緩慢生長：冷藏能減緩其增殖，卻不能視為殺菌措施；保存時間越長，污染食品中的菌數仍可能增加。
• 可耐受一定程度的鹽、酸及低水活性環境，也能在食品加工環境中存活，因而須重視加工場所的清潔與消毒。
• 具細胞內寄生能力：進入人體後可侵入宿主細胞，造成侵襲性感染。

金針菇等蔬菜可能在栽培、採收、包裝或加工過程中，因受污染的土壤、水、設備或人員操作而遭污染。加熱可有效降低活菌；單靠冷藏不能排除風險。

三、傳染來源與致病症狀

**主要傳染途徑為食入受污染的食品。**污染可能發生於原料、栽培環境、食品加工設備、包裝、運輸或保存過程。若食品未充分加熱即食用，或生熟食處理不當造成交叉污染，便可能使病原菌進入人體。孕婦感染後也可經胎盤傳染給胎兒，造成胎兒或新生兒感染。

症狀依感染者狀態與疾病型態而異：

• 腸胃型感染：常見發燒、腹瀉、噁心、頭痛或肌肉痠痛，多屬較輕微、自限性的症狀。

核心觀念

本題考酒類發酵依「原料是否須先糖化」及「糖化與酒精發酵是否同時進行」所作的分類。

酒精發酵是酵母將可發酵糖轉為乙醇與二氧化碳，基本反應可表示為：

若原料已含可發酵糖，可直接進行酒精發酵，屬單式發酵；若原料主要為澱粉，必須先糖化成糖，再由酵母發酵，則屬複式發酵。複式發酵再依糖化與酒精發酵的先後及是否同時進行，分為單行複式發酵與並行複式發酵。

解題方法

依序判斷兩件事即可：

1. **原料中的碳水化合物是否能直接供酵母發酵？**若可直接發酵，為單式發酵；若以澱粉為主、須先糖化，則為複式發酵。
2. **複式發酵的糖化與酒精發酵如何安排？**先糖化、後發酵為單行複式發酵；兩者同時進行為並行複式發酵。

四種發酵方式