113 專利師高等考試 專利師(選試專業日文及生物技術) 生物技術 考古題詳解

核心觀念

CODIS 是美國聯邦調查局（FBI）發展的 DNA 資料庫與比對系統，英文全名為 Combined DNA Index System，中文通常譯為「聯合 DNA 索引系統」。它整合地方、州及全國層級的 DNA 資料庫，用來比對犯罪現場檢體與已建檔的 DNA 型別，協助刑案偵查及身分鑑定。

CODIS 比對的核心是短串聯重複序列（short tandem repeats, STR）。STR 是基因組中特定短 DNA 序列連續重複的區域；不同個體在各 STR 位點的重複次數常有差異，因此可形成具有個人辨識力的 DNA 型別。

解題方法與原理

1. 選定 STR 位點並擴增：以聚合酶連鎖反應（PCR）擴增多個標準 STR 位點。CODIS 的標準位點集合曾隨制度更新而調整；答題重點是多位點 STR 分型，而非固定背誦位點數。
2. 測定各位點等位基因：依片段長度判定每個位點的等位基因。一般人類個體在每個常染色體位點有兩個等位基因，分別來自父母；若兩者相同，該位點即呈現同型合子。
3. 建立 DNA 型別並比對：將多個位點的等位基因組合成 DNA 型別，再與資料庫中的型別逐位點比對。

核心觀念

這題考查酸性酚／氯仿法（acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction）的 RNA 萃取原理，以及以吸光值或螢光法評估 RNA 的純度與濃度。

TRIzol、RNAzol 等試劑含有酚及異硫氰酸胍等成分。異硫氰酸胍可使蛋白質變性並抑制 RNase；酚與氯仿則在離心後形成水相、有機相及中間層，讓 RNA、DNA 與蛋白質等成分分配至不同區域。

解題方法：萃取原理與操作流程

1. 裂解與均質化：將細胞或組織加入 TRIzol 或 RNAzol，充分均質，使細胞膜與胞器破裂，釋出核酸與蛋白質。試劑中的異硫氰酸胍使蛋白質變性，降低 RNA 被 RNase 降解的風險；酚也會使蛋白質變性。
2. 加入氯仿並混合：依試劑說明加入氯仿，充分混合後靜置，使混合液分相。
3. 離心分層：離心後通常由上而下分成：

• 上層水相：主要含 RNA。
• 中間層：主要含 DNA。
• 下層有機相：主要含酚、脂質及蛋白質。

在酸性條件下，RNA 優先留在水相；DNA 多分配於中間層或有機相，蛋白質則主要進入中間層及有機相。操作時只取上層水相，避免吸到中間層，以減少 DNA 或蛋白質污染。 4. 沉澱 RNA：向水相加入異丙醇，使 RNA 沉澱，離心收集 RNA 沉澱。 5. 洗滌與溶解：以 75% 乙醇洗滌沉澱，去除鹽類及殘留酚等雜質；短暫乾燥後以無 RNA 酶水或適當緩衝液溶解。

原理重點是利用不同分子在酚／氯仿分相系統中的溶解性與分配差異，先將 RNA 分配至水相，再以醇類沉澱回收。各試劑比例、靜置時間與離心條件應依該產品說明操作。

RNA 純度與濃度分析

一、紫外光吸光值

以分光光度計或微量分光光度計測量 RNA 樣品的吸光值：

• 核酸主要在 $260\ \mathrm{nm}$ 吸收。
• 蛋白質污染常以 $280\ \mathrm{nm}$ 吸光值評估。
• 酚、胍鹽及其他有機物污染可參考 $230\ \mathrm{nm}$ 吸光值。

常用純度指標為：

純 RNA 的 $A_{260}/A_{280}$ 約為 $2.0$；比值偏低常見於蛋白質或酚污染。另可參考：

核心觀念

基因表現可由不同層次觀察：RT-qPCR 偵測特定 RNA 的量，Western blot 偵測組織或細胞萃取液中的特定蛋白量，免疫組織化學（IHC）則偵測組織切片中特定蛋白的分布與相對豐度。三者測量的分子層次、樣本型態及能回答的問題不同；RNA 表現量也不必然與蛋白量一致，因為轉譯效率、蛋白質穩定性及降解速率都會影響蛋白表現。

解題方法

依「偵測標的 → 實驗原理 → 結果如何判讀 → 優缺點與限制」逐一比較三種方法。答題時應明確指出 RT-qPCR 測量 RNA、後兩者以抗體偵測蛋白，並區分 Western blot 的蛋白質大小資訊與 IHC 的組織定位資訊。

一、RT-qPCR

原理

RT-qPCR（reverse transcription quantitative PCR，反轉錄定量聚合酶連鎖反應）先以反轉錄酶將 RNA 轉成互補 DNA（cDNA），再用特異性引子擴增目標序列，並以螢光訊號即時追蹤 DNA 增幅。螢光可來自與雙股 DNA 結合的染劑，或具有序列專一性的探針。

擴增過程中，螢光訊號超過設定閾值時的循環數稱為 $C_q$（亦常稱 $C_t$）。在擴增效率相近且接近理想倍增的條件下，$C_q$ 越低，起始目標 RNA 越多。相對定量常以內參基因校正：

若比較處理組與對照組：

當擴增效率約為 100% 時，目標基因相對表現量為：

內參基因須在各組條件下穩定表現；若效率不佳或組間差異明顯，不能直接套用 $2^{-\Delta\Delta C_q}$，應採效率校正的分析方式。

優點與限制

• **優點：**靈敏度與定量能力高、所需樣本量少、流程快速，適合比較大量樣本中特定基因的 mRNA 表現。
• **限制：**需事先知道目標序列並設計引子；RNA 易受核酸酶破壞，樣本品質、基因組 DNA 污染、引子專一性與擴增效率都會影響結果。它測量的是 RNA，不能直接證明蛋白量或蛋白功能增加。

二、Western blot analysis

原理

先裂解細胞或組織並萃取總蛋白，通常以 SDS-PAGE 依分子量分離蛋白，再將蛋白轉移至膜上。以目標蛋白的特異性一級抗體辨識，再用帶有酵素或螢光標記的二級抗體偵測訊號。目標條帶的位置可用來判斷表觀分子量，條帶訊號強度則在適當定量範圍內，反映目標蛋白的相對含量。通常須以內參蛋白或總蛋白染色校正上樣量與轉膜差異。

優點與限制

核心觀念

**Exosome（外泌體）**是細胞分泌至細胞外的膜性囊泡，典型直徑約 30–150 nm。它源自細胞內的內體（endosome）系統：內體膜向內出芽形成腔內囊泡（intraluminal vesicles, ILVs），含有多個囊泡的多囊泡體（multivesicular body, MVB）與細胞膜融合後，將 ILVs 釋放至細胞外；釋出的 ILVs 即稱外泌體。

外泌體具有脂質雙層膜，內含蛋白質、脂質及核酸，例如 mRNA、microRNA 等，可在細胞間運送訊息並影響受體細胞的功能。它不同於由細胞膜直接向外出芽形成的微囊泡（microvesicle／ectosome）。

嚴謹而言，「外泌體」是指具有特定內體來源的細胞外囊泡；僅以粒徑或分離方法取得的囊泡，未必已證明其生合成來源。因此，若來源尚未確認，宜稱為「細胞外囊泡」（extracellular vesicles, EVs）或「小型細胞外囊泡」。

解題方法：取得與純化

答題可依序說明樣本來源、分離原理、純化及確認方式。常見樣本包括細胞培養液、血漿、血清、尿液及其他體液；不同來源樣本皆須適當去除細胞與細胞碎片。

差速超高速離心是傳統常用方法。先以低速離心去除細胞及大型碎片，再逐步提高離心力，去除較大的囊泡與顆粒，最後以超高速離心沉降小型囊泡；沉澱可再洗滌、重懸，以提高純度。此法設備需求高、耗時，且容易共同沉降蛋白質聚集物或其他顆粒，回收量與純度也會受樣本及操作條件影響。

其他分離或純化方法包括：

• 密度梯度離心：依顆粒浮力密度分離，可進一步提高純度，但操作較繁複。
• 尺寸排阻層析（SEC）：依粒徑分離，通常較能保留囊泡結構，但可能需要後續濃縮。
• 超濾或切向流過濾：依粒徑截留並濃縮，適合較大量樣本處理；濾膜吸附或堵塞可能影響回收。
• 免疫親和捕捉：利用外泌體表面標誌分子捕捉特定族群，選擇性較高，但會受到標誌表現差異及捕捉效率限制。
• 聚合物沉澱：操作簡便、回收率可觀，但常會連同可溶性蛋白質及其他顆粒一併沉澱，純度較低。

核心觀念

本題考查的是：從細胞或動物疾病模式發現化合物 A 有治療效果，如何判斷這項發現能否轉化為發明專利，以及說明書須揭露哪些資料，才能支持所請求的醫藥用途。

以命題當年（民國 113 年）法規為準。依專利法第 21 條，發明是利用自然法則之技術思想的創作；依同法第 22 條，發明須具產業利用性、新穎性及進步性。專利法第 24 條第 2 款排除人類或動物之診斷、治療或外科手術方法。因此，直接請求「以化合物 A 治療疾病 X 的方法」會涉及法定不予專利標的；通常應以醫藥用途請求項表達，例如：「化合物 A 用於製備治療疾病 X 之醫藥組成物的用途」。

若化合物 A 本身是新化合物，可評估請求化合物本身及其醫藥用途；若 A 已知，單純發現它有新治療用途，仍可就該新醫藥用途主張專利，但須與先前技術區別，並符合各項專利要件。

解題方法

依序判斷「發現能否構成發明」、「請求項如何撰寫」、「實驗資料是否足以支持用途」：

1. 辨明發明標的：發現自然現象或化合物效果本身，不當然等於可專利發明；若能具體提出化合物 A 用於治療特定疾病的技術應用，則可評估作為醫藥用途發明。
2. 選擇適當請求項：避開直接請求人體或動物治療步驟，以製備特定治療用途醫藥組成物的用途請求項表達。
3. 逐項檢驗要件：判斷產業利用性、新穎性、進步性，並確認說明書充分揭露、請求項明確且受說明書支持。
4. 核對實驗與主張範圍：細胞或動物模式的結果可作為支持療效的證據；但須讓該領域通常知識者能理解，試驗結果如何支持「治療特定疾病」的用途。僅顯示與疾病相關的活性或生物標記變化，未必足以證明治療效果。

申請專利內容應闡述的重點

一、化合物 A 的界定與用途

說明化合物 A 的化學名稱、結構、必要的物理化學特性、製備方式及可辨識資料；若 A 是混合物、生物來源物質或具有不同形式的化合物，應明確界定所請求的材料。並具體指出欲治療的疾病、適用對象，以及 A 所產生的藥理作用或治療效果。

不宜只寫「A 具有生物活性」或「A 可治療疾病」等籠統敘述；須明確對應疾病及用途。

二、疾病模式與實驗設計

交代所使用的細胞或動物疾病模式如何建立、為何能代表該疾病，以及試驗流程。至少應說明受試組與適當對照組、化合物 A 的濃度或劑量、給藥或處理方式、試驗時間、評估指標及重複次數等，使他人能據以重現試驗。

三、療效結果與資料解讀

提出足以支持療效的結果，例如疾病表徵改善、腫瘤或病灶變化、生存率、症狀指標、相關生理功能或病理變化；並提供適當的定量資料與對照結果。說明觀察到的變化如何支持 A 對特定疾病的治療用途，而不只是細胞毒性、一般性抑制作用或與疾病的間接關聯。