110 地方特考三等 衛生行政 醫用微生物及免疫學 考古題詳解

核心觀念

本題整合臨床微生物實驗室常用的「染色、培養基與生化鑑定試驗」。作答時應依序寫出：

1. 原理：培養基中的選擇性或鑑別性成分、染色劑與化學反應。
2. 判讀：菌落外觀、顏色、溶血或試管顏色變化。
3. 臨床應用：用於篩檢、分離、初步鑑定及鑑別哪些病原菌。

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（一）Acid-fast 染色（抗酸染色）

1. 原理

分枝桿菌細胞壁含有大量脂質，尤其是 mycolic acid（分枝菌酸），使細胞壁具有高度疏水性。細菌一旦吸附 carbol fuchsin 後，不易被酸性脫色劑洗去，因此稱為「抗酸性」。

常用方法包括：

• Ziehl–Neelsen stain：以熱力促進染劑進入細胞。
• Kinyoun stain：提高 phenol 濃度，不需加熱。
• Auramine-rhodamine fluorescent stain：以螢光染劑染色，適合大量檢體初篩。

2. 操作與判讀

以 Ziehl–Neelsen 染色為例：

1. 初染：carbol fuchsin。
2. 脫色：acid-alcohol。
3. 複染：methylene blue 或 brilliant green。

判讀如下：

• 抗酸菌：呈紅色或桃紅色細長桿菌。
• 非抗酸菌及背景：被脫色後呈藍色或綠色。

螢光染色時，抗酸菌通常呈現黃橘色螢光桿狀物。

3. 臨床應用

主要用於檢測：

• Mycobacterium tuberculosis complex。
• 非結核分枝桿菌。
• Mycobacterium leprae。
• 部分 Nocardia 可呈現弱抗酸性或部分抗酸性。

可應用於痰液、支氣管沖洗液、胃液、膿液、組織及體液檢體，以進行結核分枝桿菌初步篩檢。

須注意，抗酸染色陽性只能表示檢體內存在抗酸性微生物，不能單靠染色區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，仍須配合培養、核酸檢測及藥物感受性試驗。

解題技巧

看到「mycolic acid、不易被 acid-alcohol 脫色、紅色桿菌」即可判定抗酸染色的核心。答案必須同時寫出抗酸菌紅色、背景藍色，才能完整呈現判讀。

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（二）Buffered Charcoal Yeast Extract（BCYE）agar

1. 原理

BCYE agar 是培養 Legionella species 的專用培養基，其主要成分及功能如下：

• Yeast extract：提供胺基酸、維生素及其他營養。
• L-cysteine：為 Legionella 生長所需的重要還原性營養素。
• Ferric pyrophosphate 或 iron salts：提供鐵離子，協助生長。
• Activated charcoal：吸附培養基中可能抑制 Legionella 的有毒代謝物、脂肪酸及過氧化物。
• α-ketoglutarate：可促進部分 Legionella 生長，因此常稱為 BCYE-α。
• Buffer：維持適合的酸鹼值。

部分培養基會加入 glycine、vancomycin、polymyxin B、cycloheximide 等抗生素或抗黴菌成分，形成選擇性培養基，例如 GVPC agar，以抑制其他細菌與真菌。

2. 判讀

Legionella 在 BCYE agar 上通常形成：

• 灰白色或淡灰色菌落。
• 表面呈現「ground-glass」外觀。
• 菌落可有切割玻璃般的光澤。
• 生長速度較慢，通常需培養數天。

重要鑑別原則：

• 在含 L-cysteine 的 BCYE 上生長。
• 在缺乏 L-cysteine 的培養基上通常不生長。

3. 臨床應用

用於分離呼吸道檢體中的：

• Legionella pneumophila。
• 其他 Legionella species。

適用檢體包括痰液、支氣管沖洗液、肺組織及其他呼吸道檢體。臨床上可用於診斷社區型肺炎、醫療照護相關肺炎及群聚型退伍軍人病。

解題技巧

BCYE 的關鍵字是：

Legionella、L-cysteine、iron、yeast extract、charcoal detoxification。

不能只寫「含酵母萃取物所以營養豐富」，必須指出 L-cysteine 是重要生長需求，charcoal 用來吸附抑制性物質。

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（三）Birdseed agar

1. 原理

Birdseed agar 又稱 niger seed agar 或含咖啡酸培養基，含有：

• Niger seed extract。
• Caffeic acid。
• 其他可作為酚類氧化酵素受質的物質。

Cryptococcus neoformans 與 Cryptococcus gattii 可產生 phenol oxidase，主要為 laccase，將 caffeic acid 氧化成醌類，再聚合形成黑褐色的 melanin。

2. 判讀

陽性結果：

• 菌落呈棕色、深褐色至黑色。
• 色素通常由菌落本身產生，而不是培養基單純變色。

陰性結果：

• 多數其他酵母菌不產生足量 laccase。
• 菌落維持乳白色、灰白色或原有顏色。

3. 臨床應用

主要用於初步鑑定：

• Cryptococcus neoformans。
• Cryptococcus gattii。

這兩種酵母菌可造成：

• 隱球菌性腦膜炎。
• 肺部隱球菌感染。
• 免疫低下患者的播散性感染。
• 免疫功能正常者的中樞神經或肺部感染，尤其是 C. gattii。

Birdseed agar 適合搭配菌落形態、墨汁染色、莢膜抗原檢測及尿素酶試驗使用，不能單獨作為最後的種別鑑定。

解題技巧

記憶方式是：

Cryptococcus 會把 caffeic acid 變成 melanin，因此菌落變棕黑色。

看到「birdseed、niger seed、caffeic acid、brown colony、phenol oxidase」即應連結到 Cryptococcus。

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（四）Sodium polyanethol sulfonate（SPS）紙錠

1. 原理

Sodium polyanethol sulfonate 是一種具有抑菌作用的多陰離子化合物，可對部分細菌造成生長抑制。將含 SPS 的紙錠置於接種細菌的血液培養基上，培養後觀察紙錠周圍是否形成抑菌圈。

2. 判讀

在厭氧性革蘭氏陽性球菌的初步鑑定中：

• Peptostreptococcus anaerobius 對 SPS 敏感。
• 紙錠周圍會形成明顯抑菌圈。
• 其他許多厭氧性革蘭氏陽性球菌通常不呈現同樣程度的抑制。

實際判讀應依實驗室所採用的標準判定抑菌圈大小，不能只根據菌落本身的外觀判讀。

SPS 紙錠也可用於 Gardnerella vaginalis 的初步鑑定。在適當血液培養基上，SPS 可造成其生長受抑，並可觀察紙錠附近的溶血反應變化；此結果需配合革蘭氏染色、觸媒酶試驗及菌落形態判定。

3. 臨床應用

主要用途包括：

核心觀念

本題考查抗黴菌藥物依「作用標的」所作的分類，以及兩種藥物對不同病原黴菌的抗菌差異。

抗黴菌藥物主要攻擊真菌特有構造或代謝途徑：

• 細胞膜中的 ergosterol
• ergosterol 的合成途徑
• 細胞壁 β-1,3-glucan
• 核酸合成
• 細胞分裂所需的微管

真菌與人體細胞皆為真核細胞，因此藥物選擇性主要來自真菌具有 ergosterol、細胞壁及特有代謝酵素。

解題方法

作答時先列出六種作用機制不同的抗黴菌藥物，再以「作用標的—主要機制—代表藥物」說明。最後分別比較 Amphotericin B 與 flucytosine 對 Aspergillus 及 Talaromyces marneffei 的效果。

可將比較整理為下列四個組合：

1. Amphotericin B 對 Aspergillus
2. Amphotericin B 對 Talaromyces marneffei
3. Flucytosine 對 Aspergillus
4. Flucytosine 對 Talaromyces marneffei

六類作用機制不同的抗黴菌藥物

一、Polyene 類：Amphotericin B

Amphotericin B 會與真菌細胞膜中的 ergosterol 結合，形成跨膜孔洞，使鉀離子、電解質及小分子物質外漏，造成細胞膜功能喪失，最後導致真菌死亡。

$$\text{Amphotericin B}+\text{ergosterol} \rightarrow \text{膜孔洞形成} \rightarrow \text{細胞內容物外漏}$$

代表藥物：Amphotericin B。

其主要副作用包括腎毒性、低血鉀、低血鎂及輸注反應。

二、Azole 類：Voriconazole

Azole 類抑制真菌的 lanosterol $14\alpha$-demethylase，阻斷 ergosterol 合成，使細胞膜中 ergosterol 缺乏，並累積異常 sterol，導致細胞膜功能障礙。

$$\text{Lanosterol} \xrightarrow[\text{被抑制}]{14\alpha\text{-demethylase}} \text{Ergosterol}$$

代表藥物：Voriconazole。

Voriconazole 是侵襲性 Aspergillus 感染的重要治療藥物。

三、Echinocandin 類：Caspofungin

Echinocandin 類抑制 β-1,3-glucan synthase，減少細胞壁 β-1,3-glucan 的生成，使真菌細胞壁失去完整性，尤其對 Candida 具有良好效果，對 Aspergillus 主要呈抑制菌絲生長作用。

代表藥物：Caspofungin。

真菌具有細胞壁而人體細胞沒有，因此此類藥物具有良好的選擇性毒性。

四、抗代謝物類：Flucytosine

Flucytosine 可進入真菌細胞，經 cytosine permease 運入後，由 cytosine deaminase 轉換成 5-fluorouracil，進一步形成：

• 5-fluorodeoxyuridine monophosphate，抑制 thymidylate synthase，阻斷 DNA 合成。
• 5-fluorouridine triphosphate，干擾 RNA 合成及蛋白質製造。

$$\text{Flucytosine} \rightarrow 5\text{-FU} \rightarrow \begin{cases} \text{抑制 DNA 合成}\\ \text{干擾 RNA 合成} \end{cases}$$

代表藥物：Flucytosine。

Flucytosine 容易產生抗藥性，因此通常不單獨使用，常與 Amphotericin B 合併治療 Cryptococcus neoformans。

五、Allylamine 類：Terbinafine

Terbinafine 抑制 squalene epoxidase，使 ergosterol 合成受阻，並造成 squalene 在細胞內堆積，對皮癬菌特別有效。

$$\text{Squalene} \xrightarrow[\text{被抑制}]{\text{squalene epoxidase}} \text{Ergosterol 前驅物}$$

代表藥物：Terbinafine。

主要用於皮癬菌感染，例如甲癬、體癬及足癬。

六、抑制細胞分裂類：Griseofulvin

Griseofulvin 與真菌的微管蛋白結合，干擾有絲分裂紡錘體形成，使細胞停留於分裂期；同時會沉積於新生角蛋白，使角質組織對皮癬菌產生抑制作用。

代表藥物：Griseofulvin。

主要用於皮膚、毛髮及指甲的皮癬菌感染，對深部黴菌感染無效。

Amphotericin B 與 Flucytosine 的比較

病原菌	Amphotericin B	Flucytosine
Aspergillus	具有抗菌活性，但效果受菌種及菌株差異影響；

核心觀念

本題考查三個層次：

1. Mucosa-associated lymphoid tissue（MALT）的定義與組成
2. Gastrointestinal-associated lymphoid tissue（GALT）在腸道免疫中的重要性
3. Gamma-delta T cells（$\gamma\delta$ T cells）在腸道防禦與黏膜恆定中的功能

作答時應依序由「定義」寫到「GALT功能」，最後集中說明 $\gamma\delta$ T cells，形成完整的黏膜免疫架構。

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一、Mucosa-associated lymphoid tissue 的定義

Mucosa-associated lymphoid tissue，簡稱 MALT，是分布於各種黏膜及其周圍組織中的淋巴組織，主要負責監測由外界經黏膜進入體內的抗原，並啟動局部免疫反應。

黏膜包括消化道、呼吸道及泌尿生殖道，均與外界相通，經常接觸食物抗原、正常菌叢及病原體。因此，MALT是人體重要的第一線免疫防禦系統。

MALT可分為：

• GALT：gastrointestinal-associated lymphoid tissue，胃腸道相關淋巴組織。
• NALT：nasopharynx-associated lymphoid tissue，鼻咽相關淋巴組織。
• BALT：bronchus-associated lymphoid tissue，支氣管相關淋巴組織。
• 其他位於泌尿生殖道等黏膜的相關淋巴組織。

MALT的特色如下：

1. 多數為非包膜性淋巴組織

與脾臟、淋巴結不同，MALT通常沒有完整包膜，常以瀰漫性淋巴球、淋巴濾泡或聚集性淋巴組織的形式分布於黏膜固有層及黏膜下層。

2. 含有先天性與後天性免疫細胞

MALT中可見：

• B cells及抗體分泌細胞
• T cells
• dendritic cells
• macrophages
• innate lymphoid cells
• 上皮內淋巴球，包括 $\gamma\delta$ T cells

3. 具有抗原取樣與局部免疫功能

MALT透過上皮細胞、M cells及抗原呈現細胞取得腔內抗原，再誘導B細胞與T細胞反應，尤其是產生分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA, sIgA）。

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二、GALT的組成與抗原辨識方式

GALT主要位於腸道黏膜及黏膜下層，是人體最大的黏膜免疫系統之一。

1. 主要組成

GALT包括：

• Peyer’s patches
• isolated lymphoid follicles
• appendix中的淋巴組織
• 腸道固有層中的瀰漫性淋巴細胞
• mesenteric lymph nodes（MLNs）
• 腸上皮內淋巴球（intraepithelial lymphocytes, IELs）

Peyer’s patches主要位於迴腸，含有B細胞濾泡、T細胞區及生發中心，是腸道抗原辨識與淋巴球活化的重要部位。

2. M cells負責抗原取樣

Peyer’s patches上方的濾泡相關上皮中含有特殊的 M cells。M cells具有下列功能：

1. 捕捉腸腔中的細菌、病毒及其他抗原。
2. 以transcytosis方式將抗原運送至上皮下方。
3. 將抗原交給dendritic cells、macrophages及淋巴球處理。

M cells是腸腔與GALT之間的重要抗原運輸通道，但部分病原體也會利用M cells進入宿主。

3. 腸道抗原可誘導免疫反應或免疫耐受

GALT必須區分：

• 有害病原體
• 共生菌
• 食物抗原
• 自體抗原

針對病原體，GALT啟動保護性免疫反應；針對食物抗原與多數共生菌，則透過調節型T細胞、免疫抑制性細胞激素及其他耐受機制，形成 oral tolerance，避免持續性腸道發炎。

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三、GALT的重要性

1. 建立腸道第一線防禦

腸道是病原體最容易進入人體的部位之一。GALT透過抗原辨識、淋巴球活化及抗體產生，對腸道病原體形成局部防禦。

其防禦層次包括：

• 腸上皮細胞形成物理屏障
• mucus及antimicrobial peptides限制微生物接近上皮
• sIgA中和病原體及毒素
• T cells及其他效應細胞清除感染細胞
• macrophages與dendritic cells處理入侵抗原

2. 產生及分布腸道特異性IgA

GALT是腸道IgA反應的主要誘導場所。B細胞在細胞激素及T細胞協助下進行class-switch recombination，轉變為IgA-producing plasma cells。

IgA經由上皮細胞上的polymeric immunoglobulin receptor運送至腸腔，形成sIgA。sIgA主要功能為：

• 中和細菌、病毒與毒素
• 阻止病原體黏附腸上皮
• 限制微生物穿越黏膜
• 調節腸道菌叢
• 在不造成強烈組織發炎的情況下執行免疫排除

此種以抗體包覆與阻隔為主的防禦方式稱為 immune exclusion。

3. 維持腸道菌叢與宿主的平衡

腸道含有大量共生微生物。GALT不僅消滅病原體，也會調節對共生菌的反應，使腸道維持免疫耐受與微生物穩定。

GALT失調可能導致：

• inflammatory bowel disease
• 過度食物過敏
• 腸道菌相失衡
• 反覆腸道感染
• 慢性黏膜發炎

4. 誘導免疫耐受

腸道每天接觸大量食物蛋白與微生物抗原，若對所有抗原都產生強烈發炎反應，將造成嚴重組織傷害。因此，GALT可誘導：

• regulatory T cells
• IL-10及TGF-$\beta$等免疫調節反應
• 對食物抗原及共生菌的oral tolerance

GALT的特殊價值在於同時具備「防禦病原體」與「避免對無害抗原過度反應」兩種能力。

5. 形成共同黏膜免疫系統

在GALT活化的淋巴球可經淋巴與血液循環，分布至其他黏膜部位。因此，腸道免疫反應不只侷限於腸道，而是與全身共同黏膜免疫系統相互連結。

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四、$\gamma\delta$ T cells的特性

核心觀念

本題整合考查 coronavirus 的病毒學基本架構，答題應依序掌握：

1. 病毒顆粒與基本結構
2. 基因組組成及表現方式
3. 結構蛋白質與非結構蛋白質功能
4. 病毒複製週期
5. 人類 coronavirus 所造成的疾病

Coronavirus 屬於冠狀病毒科（Coronaviridae），為具包膜、單股正向 RNA 病毒。其基因組可直接作為 mRNA 使用，並以「先合成複製酶，再進行 RNA 複製與結構蛋白表現」為核心複製策略。

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一、基本結構

Coronavirus 病毒顆粒大致呈球形，直徑約 $80$～$160$ nm，具有下列構造：

1. 脂質包膜（envelope）

包膜來自宿主細胞膜系統，病毒成熟與出芽主要發生於內質網—高基氏體中間區（ERGIC）。包膜上的病毒蛋白負責病毒附著、進入細胞及組裝。

2. 棘蛋白（spike protein, S）

S 蛋白形成病毒表面明顯的棘狀突起，因外觀類似日冕而得名 coronavirus。

S 蛋白可分為：

• S1 次單位：含受體結合區（receptor-binding domain, RBD），負責辨認宿主細胞受體。
• S2 次單位：含融合胜肽及膜融合區，負責病毒包膜與宿主細胞膜融合。

不同 coronavirus 使用不同細胞受體，例如：

• SARS-CoV、SARS-CoV-2：主要利用 ACE2
• MERS-CoV：利用 DPP4（CD26）
• HCoV-229E：利用 aminopeptidase N（APN）
• HCoV-NL63：利用 ACE2
• HCoV-OC43、HKU1：主要與含唾液酸結構的細胞表面分子作用

3. 膜蛋白（membrane protein, M）

M 蛋白為包膜中含量最多的蛋白，具有多重跨膜區，主要功能包括：

• 維持病毒顆粒形態
• 決定病毒包膜的彎曲與組裝
• 與 N 蛋白、E 蛋白及病毒 RNA 共同協調病毒成熟
• 參與病毒出芽

4. 包膜蛋白（envelope protein, E）

E 蛋白為小型膜蛋白，數量少但對病毒生命週期十分重要，功能包括：

• 參與病毒組裝與出芽
• 調節膜通透性，形成離子通道
• 影響病毒釋放
• 參與宿主細胞發炎反應及致病性

5. 核衣殼蛋白（nucleocapsid protein, N）

N 蛋白與病毒 RNA 結合，形成核糖核蛋白複合體（ribonucleoprotein complex），功能包括：

• 包裝病毒基因組 RNA
• 保護 RNA 不被降解
• 協助 RNA 複製與轉錄
• 參與病毒組裝及出芽

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二、基因組

Coronavirus 基因組是目前已知 RNA 病毒中最大的基因組之一，長度約 $27$～$32$ kb，具有：

• 單股 RNA
• 正向極性（positive-sense）
• $5'$ 端帽結構（$5'$ cap）
• $3'$ 端 poly(A) tail
• 無分節基因組

基因組排列具有高度保守性：

$$5' - \text{ORF1a/1b} - S - E - M - N - 3'$$

部分病毒在結構蛋白基因之間含有 accessory genes。

1. ORF1a/ORF1b

基因組 $5'$ 端約占全長三分之二，包含 ORF1a 與 ORF1b。

感染初期，宿主核糖體先翻譯 ORF1a，產生 polyprotein：

$$pp1a$$

部分核糖體在 ORF1a 與 ORF1b 交界處發生 -1 ribosomal frameshift，繼續翻譯 ORF1b，形成：

$$pp1ab$$

pp1a 與 pp1ab 之後經病毒蛋白酶切割，產生非結構蛋白 nsp1～nsp16，組成複製—轉錄複合體。

2. 結構蛋白基因

主要包括：

$$S,\ E,\ M,\ N$$

分別編碼棘蛋白、包膜蛋白、膜蛋白及核衣殼蛋白。

3. Accessory genes

不同 coronavirus 的 accessory proteins 並不完全相同，通常不直接構成病毒顆粒，但可：

• 抑制宿主先天免疫
• 干擾干擾素訊號
• 改變細胞膜及細胞器功能
• 增強病毒適應性與致病性

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三、非結構蛋白質及其功能

nsp1～nsp16 由 pp1a 與 pp1ab 切割產生，主要參與病毒 RNA 複製、轉錄、蛋白質加工、免疫逃逸及宿主細胞調控。

非結構蛋白	主要功能
nsp1	抑制宿主 mRNA 翻譯，降低宿主抗病毒蛋白生成，協助免疫逃逸
nsp2	參與宿主細胞內膜性胞器及複製環境調節
nsp3	大型多功能蛋白，含 papain-like protease（PLpro），負責切割 polyprotein；亦具有去泛素化及去 ISG15 化功能，抑制先天免疫
nsp4	與 nsp3 共同誘導雙膜囊泡（double-membrane vesicles, DMVs），形成 RNA 複製場所
nsp5	主蛋白酶（main protease, Mpro；亦稱 3CLpro），切割 pp1a、pp1ab，是重要抗病毒藥物標的
nsp6	參與雙膜囊泡形成及自噬相關膜結構調節
nsp7	與 nsp8 組成 RNA polymerase 輔助複合體
nsp8	協助 RNA 複製酶運作，具有 primer 生成及輔助聚合酶功能
nsp9	單股 RNA 結合蛋白，協助 RNA 複製
nsp10	為 nsp14 與 nsp16 的輔助因子，參與 RNA 校對及 5' 端加帽
nsp11	為 pp1a 切割產生的小型胜肽，位於 nsp10 前端
nsp12	RNA-dependent RNA polymerase（RdRp），負責以 RNA 為模板合成 RNA，是病毒複製核心酵素
nsp13	解旋酶（helicase）及 NTPase，分開 RNA 雙股結構並提供核苷酸水解能量
nsp14	具有 3'～5' exonuclease 校對功能，並參與 RNA 5' 端加帽
nsp15	Endoribonuclease，切割雙股 RNA 或異常 RNA，降低宿主對病毒 RNA 的辨識
nsp16	2'-O-methyltransferase，完成 RNA 5' 端帽結構修飾，使病毒 mRNA 類似宿主 mRNA，降低免疫辨識

其中最重要的考點為：

• nsp3、nsp5：切割病毒 polyprotein
• nsp12：RNA 複製酶
• nsp13：解旋酶
• nsp14：RNA 校對與加帽
• nsp16：RNA 2'-O methylation
• nsp10：nsp14、nsp16 的輔助因子