109 地方特考三等 衛生技術 生物技術學 考古題詳解

核心觀念

SARS-CoV-2 是具有包膜的正股單股 RNA 病毒。COVID-19 診斷可依檢測標的分為病毒核酸、病毒抗原、病毒抗體及病毒培養等方法。本題所問的兩種常用實驗室診斷方法，依民國 109 年的疫情與檢測脈絡，主要是：

1. 病毒核酸檢測：以即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應（real-time RT-PCR）偵測病毒 RNA。
2. 病毒抗原檢測：以抗體辨識檢體中的病毒蛋白，常見形式包括抗原快篩與酵素連結免疫吸附分析（ELISA）。

兩者都可用於感染診斷，但核酸檢測對低病毒量較敏感；抗原檢測較快、操作較簡便，通常在病毒量較高時較容易檢出。

（一）檢體種類與前處理流程

1. 檢體種類

以呼吸道檢體為主：

• 上呼吸道檢體：鼻咽拭子、鼻腔拭子、口咽拭子、鼻咽抽取液或沖洗液。一般診斷常採鼻咽拭子；若同時採取鼻咽與口咽拭子，可依檢驗規範放入同一病毒保存液中送驗。
• 下呼吸道檢體：有下呼吸道症狀者可採深部咳出的痰液；不宜為採檢而誘導咳痰，以免增加氣溶膠暴露。

血清可用於抗體檢測，但急性感染的常規病毒核酸或抗原檢測，以呼吸道檢體為主。

2. 採檢與前處理

1. 採集檢體：鼻咽或口咽採檢使用合成纖維拭子，採樣後置入含病毒保存液的無菌運送管；痰液則採集深部自咳痰液，置入無菌容器。
2. 標示與運送：確認檢體身分與採檢時間，依感染性檢體規範密封、包裝及運送；盡量維持低溫，並避免長時間延遲。
3. 實驗室處理：在適當生物安全防護下接收檢體，視需要混勻、分裝或稀釋。進行核酸檢測時，從檢體中萃取病毒 RNA；進行抗原檢測時，依試劑規範將檢體加入萃取液或處理液，使病毒蛋白釋出，再加入檢測系統。
4. 品質與安全控制：全程避免交叉污染，依檢驗流程加入陽性、陰性及內部控制。未經處理的檢體仍須視為有感染風險。

（二）兩種檢測方法、原理、流程與比較

1. 病毒核酸檢測：即時 RT-PCR

原理： 先將病毒 RNA 反轉錄成互補 DNA（cDNA），再以病毒特異性引子擴增目標基因片段。反應中使用螢光探針或螢光染劑，即時偵測擴增產物；螢光訊號達到設定閾值所需的循環數稱為 Ct 值。在相同檢測條件下，Ct 值越低，通常代表檢體中的目標核酸量越高。

基本流程：

1. 由呼吸道檢體萃取病毒 RNA。
2. 將 RNA、反轉錄酵素、DNA 聚合酵素、病毒特異性引子與螢光探針等加入反應系統。
3. 進行反轉錄與 PCR 循環，儀器同步讀取螢光訊號。
4. 依試劑設定的判讀標準、Ct 值及內部控制結果，判定為陽性、陰性或無效／需重測。

優點：

• 靈敏度高，病毒量較低時仍有機會檢出。
• 可直接偵測病毒遺傳物質，適合確認急性感染。
• 特異性高，適當的引子與探針可辨識 SARS-CoV-2 特定序列。

限制：

• 需要核酸萃取設備、專業人員及實驗室流程，成本與設備需求較高。
• 從檢體處理到完成判讀的時間通常較長。
• 採檢品質不佳、檢體中抑制物或污染，都可能造成偽陰性或偽陽性。
• 檢出 RNA 不等於證明檢體內仍有具感染力的完整病毒。

核心觀念

本題考查 SARS-CoV-2 的細胞感染機制，以及疫苗如何呈現病毒抗原、誘發免疫反應。病毒感染呼吸道細胞的關鍵步驟是：病毒表面的棘蛋白（spike protein, S protein）與宿主細胞受體結合，經宿主蛋白酶活化後進入細胞，再利用宿主細胞的生合成系統複製與組裝。

題目中的四種疫苗策略，主要差異在於「抗原如何送入人體、是否含有完整病毒，以及是否需要在體內表現抗原」。

解題方法

先依病毒感染順序說明「附著、活化、進入、複製、組裝與釋出」；再找出病毒與宿主細胞結合時的病毒蛋白及宿主受體。疫苗比較則依抗原來源、人體內是否表現抗原、免疫反應特性及製備安全性整理。

（一）SARS-CoV-2 感染並進入呼吸道細胞的過程

1. **附著：**病毒表面的 S 蛋白受體結合區（receptor-binding domain, RBD）與呼吸道細胞表面的血管收縮素轉化酶 2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）結合。
2. **活化：**宿主細胞表面的蛋白酶（如 TMPRSS2），或內體中的蛋白酶，切割並活化 S 蛋白，使病毒膜蛋白具備促進膜融合的能力。
3. **進入細胞：**病毒可經由病毒套膜與細胞膜融合，或透過受體媒介的內吞作用進入細胞；病毒膜與細胞膜融合後，病毒核酸釋入細胞質。
4. **複製與蛋白質合成：**SARS-CoV-2 是正股單股 RNA 病毒。其基因組 RNA 可在細胞質中作為訊息 RNA 使用，先翻譯出複製相關蛋白，再由病毒 RNA 依賴性 RNA 聚合酶合成新的病毒 RNA，並翻譯病毒結構蛋白。
5. **組裝與釋出：**新合成的基因組 RNA 與病毒蛋白在細胞內組裝成新病毒，之後經細胞內膜系統運送並釋出，再感染其他細胞。

（二）疫苗標靶蛋白

應以 SARS-CoV-2 的棘蛋白 S 蛋白為主要標靶，尤其是其 RBD。RBD 負責與宿主細胞 ACE2 結合；誘發可阻斷此結合的中和抗體，可減少病毒附著及進入呼吸道細胞。

ACE2 是宿主細胞受體，不是病毒的標靶抗原。以病毒 S 蛋白作為疫苗抗原，可使免疫系統產生針對病毒的抗體，阻礙感染起始步驟。

（三）四種 SARS-CoV-2 疫苗策略比較

核心觀念

本題考查萊克多巴胺的藥理作用、豬肉檢體進行 LC-MS/MS 分析前的萃取與淨化、串聯質譜定量原理，以及 ppb 與質量濃度單位的換算。

（一）萊克多巴胺及其藥理作用

萊克多巴胺（ractopamine）是一種合成的乙型腎上腺素受體促效劑，屬於俗稱「瘦肉精」的乙型受體素。動物攝入後，藥物與乙型受體結合，促進細胞內環腺苷單磷酸（cAMP）訊息傳遞，使營養代謝偏向肌肉蛋白質合成與脂肪分解，增加瘦肉比例、減少脂肪沉積，並可改善飼料利用效率。其乙型受體作用也可能影響心臟與平滑肌功能。

（二）LC-MS/MS 上機前的樣品備置

豬肉組織含有脂肪、蛋白質等基質成分，可能干擾分析，因此前處理的目的，是把萊克多巴胺從組織中萃取出來，並去除共萃取的干擾物。標準流程可依驗證過的檢驗方法進行，主要步驟如下：

1. 取具代表性的豬肉檢體，均質化並秤取定量樣品。
2. 加入適當萃取溶劑，使萊克多巴胺從肉品基質中釋出；若方法需要，也可先進行酵素水解或去結合處理，以釋出結合型殘留。
3. 振盪或均質混合後離心，收集含待測物的上清液。
4. 以固相萃取（SPE）或 QuEChERS 等方式淨化萃取液，降低脂肪、蛋白質及其他基質成分造成的干擾。
5. 視方法需要濃縮或換溶劑，再以 LC 起始流動相復溶；離心或過濾後，將檢液移入樣品瓶上機分析。
6. 同批處理空白檢體、標準品及添加回收檢體，以確認背景干擾、定量準確度與分析品質。

實際秤樣量、溶劑組成、酵素處理條件、淨化材料與濃縮倍數，應依選定且完成驗證的標準作業程序固定設定。

（三）LC-MS/MS 定量原理

LC-MS/MS 結合液相層析的分離能力與串聯質譜的選擇性偵測能力：

1. **液相層析分離：**檢液注入液相層析儀後，萊克多巴胺依其與管柱固定相、流動相的作用差異而分離，並在特定滯留時間流出。
2. **第一級質譜選離子：**進入質譜後，樣品經離子化形成帶電離子。第一級質譜選取萊克多巴胺的特定母離子（前驅離子）。
3. **碰撞誘導碎裂：**前驅離子進入碰撞室，與惰性氣體碰撞後產生特定碎片離子。
4. **第二級質譜監測離子轉換：**選取特定母離子至子離子（產物離子）的轉換進行監測，常以多重反應監測（MRM）模式提升專一性與靈敏度。

核心觀念

本題考的是以 16S rRNA 基因序列進行細菌的分子鑑定，以及該序列為何適合作為微生物分類指標。16S rRNA 是原核生物 30S 核糖體小次單元的重要組成分子；實際以 PCR 擴增與定序鑑定時，分析的是編碼 16S rRNA 的基因（16S rRNA gene，常寫作 16S rDNA），而非直接擴增 RNA。

16S rRNA 基因約長 1,500 個核苷酸，具有保守區與可變區交錯排列的特徵，因此能兼顧廣泛擴增與分類辨識。

解題方法：說明「為何適用」與「如何鑑定」

一、作為指標序列的原因

1. 普遍存在且功能重要：細菌普遍具有 16S rRNA 基因，且此基因參與核糖體功能，序列受到功能限制，不易大幅改變。
2. 保守區利於設計通用引子：不同細菌的部分序列高度相似，可在保守區設計引子，擴增範圍廣，適合用於未知菌的初步分析。
3. 可變區提供分類資訊：基因中有多個可變區，不同類群的序列差異可用於判別細菌的分類位置；序列差異愈小，通常代表親緣關係愈近。
4. 長度適中且有資料可比對：序列長度足以提供辨識資訊，又便於 PCR 與定序；可將所得序列與資料庫中的參考序列比對，進行菌種或近緣類群鑑定。

二、技術原理與流程

核心觀念

ROC 曲線用來評估連續檢測結果在不同判定門檻下，對陽性個案與陰性個案的區分能力。圖中橫軸是偽陽性率，縱軸是真陽性率；改變判定門檻會改變兩者的取捨。

解題方法

先看曲線相對於左上角的位置：曲線越靠近左上角，表示在偽陽性率較低時仍能維持較高敏感度。再比較曲線下方面積，判斷整體區辨能力。若兩條曲線相交，則不同判定門檻下的表現各有優劣，須依篩檢或確診的目的選擇。

（一）橫軸與縱軸的意義

橫軸 $1-\text{specificity}$ 是偽陽性率（FPR），表示實際沒有疾病者被檢測為陽性的比例：

縱軸 sensitivity 是敏感度，也稱真陽性率（TPR），表示實際有疾病者被檢測為陽性的比例：

其中 $TP$ 為真陽性、$FN$ 為偽陰性、$FP$ 為偽陽性、$TN$ 為真陰性。敏感度越高，漏掉疾病個案的比例越低；偽陽性率越低，將無病者誤判為陽性的比例越低。

（二）ROC 曲線下面積 AUC 的意義

AUC 概括 ROC 曲線在各種判定門檻下的整體區辨能力。AUC 越大，代表方法越能區分有病者與無病者。其機率解釋為：隨機抽取一位有病者與一位無病者，有病者的檢測分數較高的機率。

AUC 為 $1$ 代表完全區分；AUC 約為 $0.5$ 代表區辨能力相當於隨機判別。AUC 衡量的是區辨能力，不等同於單一門檻下的準確率，也不直接代表陽性或陰性預測值。

（三）方法 A、B、C 的比較