110 地方特考三等 衛生技術 生物技術學 考古題詳解

核心觀念

本題考查「呼吸道病毒感染的病原學診斷」，重點在於如何由病患檢體中直接偵測病毒本身，或藉由免疫反應間接證實感染，進而鑑定造成感染的特定病毒。

常用方法可分為：

1. 病毒分離與培養
2. 病毒抗原檢測
3. 病毒核酸檢測
4. 血清學抗體檢測
5. 核酸定序與基因分型

實際診斷時，應依病程、檢體種類、病毒特性及檢測目的選擇方法。若要快速確認目前是否感染特定呼吸道病毒，臨床上以核酸檢測及抗原檢測最常使用；若需取得活病毒，則須進行病毒分離培養。

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一、病毒分離與細胞培養

檢測原理

將病患的鼻咽拭子、咽喉拭子、鼻腔分泌物、痰液或下呼吸道分泌物，接種於適合的細胞培養系統。若檢體中含有具有感染力的病毒，病毒會吸附於細胞表面，進入細胞並進行複製。

病毒複製後可造成：

• 細胞病變效應（cytopathic effect, CPE）：例如細胞圓縮、融合、脫落、形成多核巨細胞。
• 細胞內出現病毒抗原或病毒核酸。
• 培養液中病毒量增加，可再以免疫學或分子生物學方法鑑定。

病毒分離後，可利用特異性抗體進行免疫螢光染色、酵素免疫分析或中和試驗，以確認病毒種類。

優點

• 可取得活病毒，適合進一步進行病毒學研究、抗病毒藥物試驗及抗原性分析。
• 可證明檢體中存在具感染力的病毒。

限制

• 培養所需時間較長，可能需數天至數週。
• 部分呼吸道病毒不易在一般細胞培養中生長。
• 檢體保存不當、病毒量過低或病患已接受抗病毒治療，均可能造成偽陰性。
• 單純觀察細胞病變通常不能直接判定是哪一種病毒，仍須搭配特異性鑑定。

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二、病毒抗原檢測

檢測原理

利用病毒表面的特異性蛋白或病毒感染細胞內所產生的病毒蛋白，作為抗原標的。以已知的特異性抗體與病患檢體中的病毒抗原結合，再透過訊號系統顯示結果。

常見方法包括：

• 酵素免疫分析（enzyme immunoassay, EIA）
• 免疫層析快篩
• 直接或間接免疫螢光法
• 螢光微球或膠體金標記法

以免疫層析快篩為例，檢體中的病毒抗原先與帶有標記的抗體結合，複合物沿著膜層移動，若被固定於檢測區的另一株抗體捕捉，便形成可見色帶。此類設計通常屬於「雙抗體夾心法」。

其基本反應可表示為：

$$\text{捕捉抗體}+\text{病毒抗原}+\text{標記抗體} \rightarrow \text{抗體－抗原－抗體複合物}$$

優點

• 檢測速度快，適合急診、門診及群聚感染初步篩檢。
• 操作簡便，不一定需要複雜儀器。
• 可針對不同病毒設計特異性抗體，例如流感病毒、呼吸道融合病毒或冠狀病毒。

限制

• 敏感度通常低於核酸擴增檢測。
• 病毒量低時容易出現偽陰性。
• 抗原與抗體間的交叉反應可能造成偽陽性。
• 抗原快篩陽性可支持感染，但陰性結果在高度懷疑時仍須以核酸檢測確認。

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三、病毒核酸檢測

核酸檢測是目前確認特定呼吸道病毒感染最重要的方法之一。其核心是偵測檢體中是否含有該病毒特有的 DNA 或 RNA 序列。

（一）PCR 檢測

若病毒為 DNA 病毒，可直接以 PCR 擴增病毒特異性 DNA片段。PCR包括：

1. 變性（denaturation）：雙股 DNA分離成單股。
2. 引子黏合（annealing）：特異性引子與目標序列互補結合。
3. 延伸（extension）：DNA聚合酶以引子為起點合成新股 DNA。

經過多個循環後，目標序列呈指數倍增加：

$$N=N_0(1+E)^n$$

其中 $N_0$ 為起始核酸量，$E$ 為每一循環的擴增效率，$n$ 為循環數。理想狀況下每循環加倍，則：

$$N=N_0 \times 2^n$$

（二）反轉錄 PCR（RT-PCR）

許多呼吸道病毒為 RNA 病毒，例如流感病毒、呼吸道融合病毒及多數冠狀病毒。RNA不能直接作為一般 PCR 的擴增模板，因此須先以**反轉錄酶（reverse transcriptase）**將 RNA轉換成互補 DNA（cDNA），再進行 PCR。

反應流程為：

$$\text{病毒 RNA} \xrightarrow{\text{反轉錄酶}} \text{cDNA} \xrightarrow{\text{PCR}} \text{大量病毒特異性 DNA片段}$$

若將反轉錄與 PCR 置於同一反應管中，稱為**即時反轉錄聚合酶連鎖反應（real-time RT-PCR）**或一管式 RT-PCR。

（三）即時定量 PCR

即時 PCR 在擴增過程中同步偵測螢光訊號。當螢光訊號超過設定閾值時，所對應的循環數稱為 $C_t$ 值或 $C_q$ 值。

一般而言：

• $C_t$ 值越低，表示起始病毒核酸量越多。
• $C_t$ 值越高，表示起始病毒核酸量越少。
• 超過檢測平台設定的循環上限，通常判定為未檢出。

即時 PCR 可採用：

• TaqMan 探針法：探針同時具有螢光基團與淬熄基團；探針被切解後，螢光訊號增強。
• SYBR Green 法：染劑與雙股 DNA 結合後產生螢光，但專一性較低，需配合熔解曲線分析。

TaqMan 探針法的基本原理為：

$$\text{探針完整時：螢光基團受淬熄}$$ $$\text{探針被切解後：螢光基團與淬熄基團分離，產生螢光}$$

（四）多重 PCR

在同一反應中加入多組針對不同病毒的引子與探針，可同時檢測多種呼吸道病原體，例如流感病毒、呼吸道融合病毒、腺病毒及冠狀病毒。

核心觀念

本題考查抗體製備的兩大技術：

1. 雜交瘤技術（hybridoma technology）：以免疫動物取得可產生抗體的 B 細胞，與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，建立能持續分泌單株抗體的雜交瘤。
2. 噬菌體展示技術（phage display technology）：將抗體片段的基因與噬菌體外鞘蛋白基因融合，使抗體片段展示於噬菌體表面，並利用抗原親和性篩選出特定抗體。

題目所指的技術是噬菌體展示技術。其發明與發展者包括 George P. Smith 及 Sir Gregory P. Winter；兩人因噬菌體展示技術在胜肽與抗體研究上的貢獻，獲頒 2018 年諾貝爾化學獎。

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解題方法

判斷本題關鍵在於：

• 題目提到「2018 年諾貝爾化學獎」。
• 該獎與「以噬菌體展示胜肽與抗體」有關。
• 因此答案應完整說明噬菌體展示抗體技術，包括其名稱、原理、抗體庫建立、篩選、擴增與表現等步驟。

作答時應掌握一條主線：

$$\text{抗體基因庫} \rightarrow \text{抗體片段展示於噬菌體表面} \rightarrow \text{與固定抗原結合} \rightarrow \text{洗去未結合噬菌體} \rightarrow \text{洗脫、感染細菌擴增} \rightarrow \text{重複篩選與鑑定}$$

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技術名稱

本技術稱為：

• 噬菌體展示技術
• 英文為 phage display technology
• 應用於抗體時，稱為噬菌體展示抗體技術

其核心是將抗體片段展示在噬菌體外殼表面，並使攜帶該抗體片段基因的噬菌體顆粒同時保留其遺傳資訊，形成「表型與基因型連結」。

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製備原理

一、基因型與表型的連結

噬菌體展示技術將抗體片段的 DNA 序列，與噬菌體外鞘蛋白基因融合。當噬菌體感染大腸桿菌後，會表現出融合蛋白：

• 抗體片段位於噬菌體表面，屬於表型。
• 抗體片段的 DNA 位於噬菌體內，屬於基因型。

因此，研究者只要依據噬菌體表面的抗原結合能力進行篩選，即可直接取得對應的抗體基因。

這是本技術最重要的特色：

$$\text{抗原結合表現} \longleftrightarrow \text{對應抗體基因}$$

二、展示的抗體形式

常見展示形式包括：

• Fab（fragment antigen-binding）
• scFv（single-chain variable fragment）
• VHH 或 nanobody
• 完整免疫球蛋白的部分結構

其中最常用的是 scFv。scFv 將抗體的重鏈可變區（$V_H$）與輕鏈可變區（$V_L$）以柔性胜肽連接：

$$V_H-\text{linker}-V_L$$

scFv 保留抗原結合能力，但分子量較小，容易透過基因工程製備與篩選。

三、利用親和性進行選擇

將目標抗原固定於固相表面，再加入抗體噬菌體庫。能與抗原結合的噬菌體會被保留，未結合或結合力弱的噬菌體則在洗滌步驟中被去除。

這種以結合能力進行選擇的過程稱為：

• 生物淘選（biopanning）
• 親和性篩選（affinity selection）

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噬菌體展示抗體的製備步驟

第一步：取得抗體基因來源

抗體基因可以來自：

• 經抗原免疫之動物的 B 細胞
• 人體周邊血液淋巴球
• 記憶 B 細胞
• 已知抗體的基因序列
• 人工設計或合成的抗體序列

若要製備人源抗體，常以人體 B 細胞或人類抗體基因資料庫作為來源。

從 B 細胞取得 mRNA 後，利用逆轉錄酶合成互補 DNA（cDNA），再以聚合酶連鎖反應（PCR）擴增抗體可變區基因。

常見流程為：

$$\text{B 細胞} \rightarrow \text{mRNA} \rightarrow \text{cDNA} \rightarrow \text{PCR 擴增 }V_H、V_L$$

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第二步：建構抗體片段基因

將抗體重鏈及輕鏈的可變區組合成抗體片段。

以 scFv 為例：

$$V_H-\text{柔性連接胜肽}-V_L$$

柔性連接胜肽通常可使重鏈與輕鏈可變區保持適當空間排列，使其形成抗原結合位。

之後，將 scFv 或 Fab 的基因插入噬菌體展示載體，使其與噬菌體外鞘蛋白基因融合。常見外鞘蛋白包括：

• pIII
• pVIII

其中 pIII 常用於展示少量但具功能性的抗體片段；pVIII 可進行較高密度展示。

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第三步：建立噬菌體抗體庫

將重組載體導入大腸桿菌。細菌表現抗體片段與噬菌體外鞘蛋白的融合蛋白後，產生表面展示抗體片段的噬菌體。

由大量不同抗體基因組成的噬菌體集合稱為：

• 噬菌體抗體庫（phage antibody library）
• 抗體噬菌體展示庫

抗體庫的多樣性越高，越有機會找到能與目標抗原專一結合的抗體。抗體多樣性主要來自：

• $V_H$ 與 $V_L$ 的不同組合
• V、D、J 基因重組
• 互補決定區（CDR）的序列差異
• PCR 或合成設計造成的變異

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第四步：將目標抗原固定

把目標抗原固定於固相載體，例如：

• 微量盤孔
• 磁珠
• 親和性樹脂
• 生物感測器表面

固定抗原的目的，是讓特異性抗體噬菌體能在後續洗滌時被保留下來。

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第五步：加入噬菌體抗體庫進行結合

將含有大量不同抗體片段的噬菌體庫加入固定有目標抗原的固相表面。

此時會發生：

• 對抗原具有親和力的噬菌體，與抗原結合。
• 不具特異性的噬菌體，留在溶液中。
• 結合力較弱的噬菌體，可能在洗滌時被除去。

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第六步：洗滌去除非特異性噬菌體

使用適當的緩衝液反覆洗滌，去除：

• 未結合噬菌體
• 非特異性吸附噬菌體
• 親和力較弱的噬菌體

洗滌強度會影響篩選結果：

• 洗滌較弱，容易保留較多候選抗體，但非特異性背景較高。
• 洗滌較強，能提高特異性與平均親和力，但也可能淘汰結合力較弱的真實候選者。

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第七步：洗脫特異性結合噬菌體

將仍與抗原結合的噬菌體洗脫下來。常見方法包括：

• 改變 pH
• 改變離子強度
• 使用競爭性抗原
• 使用可破壞抗原—抗體作用的洗脫條件

核心觀念

本題考查特異性免疫中「體液性免疫」與「細胞性免疫」的分工，以及淋巴球如何形成龐大的抗原受體變異性。

• 體液性免疫：主要由 B 淋巴球及其分化形成的漿細胞負責，產生具有特異性的抗體。
• 細胞性免疫：主要由 **T 淋巴球（T lymphocytes）**負責，透過辨識抗原胜肽與主要組織相容性複合體（MHC）的組合，直接殺死受感染細胞、活化其他免疫細胞，或調節免疫反應。
• T 細胞的特異性來自其表面的 T 細胞受體（T-cell receptor, TCR）。不同 T 細胞具有不同 TCR，因此可辨識不同抗原。

解題方法

本題可分成兩部分作答：

1. 先指出產生細胞性免疫性的細胞名稱。
2. 再說明 T 細胞受體如何透過基因重組與受體組合，形成大量變異性。

作答時應同時涵蓋「細胞種類、抗原辨識方式、TCR 基因重組機制及增加多樣性的因素」，才能完整對應題目要求。

一、產生細胞性免疫性的細胞名稱

產生細胞性免疫性的主要細胞是 T 淋巴球。T 細胞在骨髓產生前驅細胞，之後移行至胸腺成熟，因此稱為 T 細胞。

主要類型如下：

1. 輔助型 T 細胞（helper T cell, CD4⁺ T cell）

CD4⁺ T 細胞辨識由抗原呈現細胞透過 MHC class II 所呈現的抗原胜肽，活化後可分泌細胞激素，協助其他免疫細胞作用。

常見功能包括：

• 活化巨噬細胞，增強吞噬細胞內病原體的能力。
• 協助 B 細胞增殖、分化及抗體類別轉換。
• 招募及調節其他白血球。
• 形成 Th1、Th2、Th17、Tfh 等功能性亞群。

2. 細胞毒殺型 T 細胞（cytotoxic T cell, CD8⁺ T cell）

CD8⁺ T 細胞辨識由 MHC class I 所呈現的抗原胜肽，活化後可殺死受病毒感染的細胞、腫瘤細胞及其他具有異常抗原的細胞。

主要殺傷機制包括：

• 釋放 perforin，使目標細胞膜形成孔洞。
• 釋放 granzymes，誘導目標細胞凋亡。
• 透過 Fas ligand 與 Fas 結合，啟動凋亡訊號。

3. 調節型 T 細胞（regulatory T cell, Treg）

Treg 可抑制過度免疫反應，維持免疫耐受，降低自體免疫反應發生的機會。

4. 記憶型 T 細胞（memory T cell）

初次感染後部分 T 細胞轉變為記憶型細胞。再次遇到相同抗原時，可迅速增殖並產生較強的免疫反應。

二、T 細胞如何辨識抗原

T 細胞通常不直接辨識完整、未分解的抗原。抗原必須先被處理成抗原胜肽，再由 MHC 分子呈現於細胞表面。

• CD4⁺ T 細胞主要辨識「抗原胜肽－MHC class II」複合體。
• CD8⁺ T 細胞主要辨識「抗原胜肽－MHC class I」複合體。

TCR 對抗原具有高度特異性，但完整活化通常還需要共同刺激訊號，例如 CD28 與抗原呈現細胞上的 B7 結合。此機制可避免 T 細胞僅因接觸抗原而發生不適當活化。

三、T 細胞受體產生大量變異性的主要機制

1. V、D、J 基因片段的體細胞基因重組

TCR 基因不是由單一固定序列直接形成，而是由多個基因片段重新組合。

• TCR $\alpha$ 鏈主要由 $V$ 與 $J$ 片段重組形成。
• TCR $\beta$ 鏈主要由 $V$、$D$ 與 $J$ 片段重組形成。

在 T 細胞發育過程中，基因重組酵素 RAG1（recombination activating gene 1） 與 RAG2 辨識重組訊號序列，切割 DNA，使不同的 $V$、$D$、$J$ 片段重新接合。

因此，每個 T 細胞可能選用不同的片段組合，產生不同的 TCR。

2. 組合多樣性（combinatorial diversity）

不同 $V$、$D$、$J$ 片段彼此組合，會產生大量不同的基因排列。

以 TCR $\beta$ 鏈為例，其基本組合可表示為：

$$V_i + D_j + J_k$$

其中 $V_i$、$D_j$、$J_k$ 可分別從多個基因片段中選取，因此組合數量會迅速增加。

此外，TCR 是由 $\alpha$ 鏈與 $\beta$ 鏈配對形成。不同 $\alpha$ 鏈與不同 $\beta$ 鏈的隨機配對，會再增加受體種類：

$$\text{TCR 多樣性} \approx \text{TCR }\alpha\text{ 鏈種類} \times \text{TCR }\beta\text{ 鏈種類}$$

核心觀念

本題考查免疫療法（immunotherapy）的分類、作用標的及抗癌原理。免疫療法不是直接以化學藥物殺死癌細胞，而是：

1. 增強或恢復病人原有的免疫反應，使免疫細胞能辨認並消滅腫瘤。
2. 提供外源性免疫效應分子或細胞，直接攻擊癌細胞。
3. 阻斷腫瘤的免疫逃脫機制，解除癌細胞對免疫系統的抑制。
4. 在自體免疫疾病中，則以抑制過度活化或錯誤攻擊自身組織的免疫反應為主。

癌細胞雖具有腫瘤抗原，但常透過降低抗原呈現、分泌免疫抑制性細胞激素、表現免疫檢查點配體等方式逃避免疫監視。因此，免疫療法的核心就是提升「腫瘤辨識」與「免疫攻擊」，並降低「免疫抑制」。

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解題方法

作答時可採取「分類—原理—代表療法—應用限制」的架構：

1. 先依免疫反應來源分為主動免疫療法與被動免疫療法。
2. 再依作用方式補充：

• 免疫檢查點抑制劑
• 單株抗體
• 過繼性細胞療法
• 癌症疫苗
• 細胞激素療法
• 溶瘤病毒療法

3. 說明癌症免疫逃脫與免疫療法如何逆轉此現象。
4. 補充自體免疫疾病的免疫抑制治療，可展現免疫療法的完整概念。

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一、主動免疫療法

主動免疫療法是利用抗原、佐劑或免疫調節方式，刺激病人自身的免疫系統產生抗腫瘤反應。其優點是免疫記憶較持久，缺點是產生效果較慢，且須依賴病人本身具有一定的免疫功能。

1. 癌症疫苗

癌症疫苗以腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen, TAA）、腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigen, TSA）或腫瘤細胞成分作為抗原，經抗原呈現細胞攝取、處理並呈現後，活化抗原專一性 T 細胞。

其主要原理為：

1. 樹突細胞攝取癌症抗原。
2. 抗原經處理後，以主要組織相容性複合體（MHC）呈現。
3. 活化 CD8⁺ 細胞毒性 T 淋巴球與 CD4⁺ 輔助型 T 細胞。
4. CD8⁺ T 細胞辨認癌細胞表面的抗原-MHC 複合體，造成癌細胞凋亡。

癌症疫苗可分為：

• 預防性癌症疫苗：預防病毒感染所引起的癌症，例如 HPV 疫苗可降低子宮頸癌及部分頭頸癌風險。
• 治療性癌症疫苗：用於已形成的癌症，目的在誘發抗腫瘤免疫反應。

癌症疫苗的限制包括腫瘤抗原異質性、腫瘤微環境具有免疫抑制性，以及癌細胞可能降低抗原呈現能力。

2. 細胞激素療法

細胞激素可調節免疫細胞的增生、分化及活性，常見者包括：

• 介白素-2（IL-2）：促進 T 細胞及自然殺手細胞（NK cell）增生與活化。
• 干擾素-α（IFN-α）：抑制病毒及腫瘤細胞增生，並增強抗原呈現與 NK 細胞活性。
• 粒線球－巨噬細胞群落刺激因子（GM-CSF）：促進樹突細胞與髓系細胞成熟，增強抗原呈現。

細胞激素療法可提高整體免疫攻擊能力，但因作用範圍廣，較容易產生發燒、低血壓、毛細血管滲漏症候群及全身性發炎反應等副作用。

3. 免疫調節劑

免疫調節劑透過改變免疫細胞活性或腫瘤微環境，增強抗腫瘤反應。例如部分免疫調節藥物可：

• 活化 T 細胞與 NK 細胞。
• 降低調節型 T 細胞（Treg）所造成的免疫抑制。
• 抑制腫瘤血管新生。
• 改變腫瘤相關巨噬細胞的功能。

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二、被動免疫療法

被動免疫療法是直接給予具有免疫功能的抗體、細胞或效應分子，不需等待病人自行建立完整免疫反應。其作用通常較快，但治療效果較依賴給予物質的存在時間，免疫記憶也較有限。

1. 單株抗體療法

單株抗體能專一性辨認癌細胞表面抗原，主要作用方式如下：

（1）阻斷生長訊號

癌細胞常過度表現生長因子受體。單株抗體結合受體後，可阻斷配體結合及下游訊號傳遞，抑制癌細胞增生。

例如抗 HER2 單株抗體可阻斷 HER2 訊號，應用於部分 HER2 陽性乳癌。

（2）抗體依賴型細胞媒介細胞毒作用

抗體的 Fab 端結合癌細胞抗原，Fc 端被 NK 細胞上的 Fc 受體辨認，促使 NK 細胞釋放穿孔素與顆粒酶，造成癌細胞死亡，此機制稱為 antibody-dependent cellular cytotoxicity（ADCC）。

（3）補體依賴型細胞毒作用

抗體結合癌細胞後，可活化補體系統，形成膜攻擊複合體，使癌細胞膜破裂，此作用稱為 complement-dependent cytotoxicity（CDC）。

（4）攜帶毒素或藥物

抗體可與細胞毒性藥物、毒素或放射性物質結合，形成抗體藥物複合體。抗體先專一性結合癌細胞，再被細胞內吞，釋放毒性成分，以提高對腫瘤的選擇性。

2. 免疫檢查點抑制劑

T 細胞必須受到活化與抑制訊號的平衡調節，以避免過度免疫反應。癌細胞會利用此機制抑制 T 細胞，形成免疫逃脫。

（1）CTLA-4 抑制劑

T 細胞活化需要：

1. T 細胞受體辨認抗原-MHC。
2. CD28 與抗原呈現細胞上的 B7 分子結合，提供共同刺激訊號。

CTLA-4 與 B7 的結合力高於 CD28，會抑制 T 細胞活化。CTLA-4 抑制劑可阻斷此抑制訊號，使 T 細胞維持活化狀態。

（2）PD-1／PD-L1 抑制劑

PD-1 位於 T 細胞表面，PD-L1 可表現於腫瘤細胞或腫瘤微環境中的細胞。PD-1 與 PD-L1 結合後，會抑制 T 細胞增生、細胞激素分泌及殺傷功能，導致 T 細胞耗竭。

抗 PD-1 或抗 PD-L1 抗體可阻斷此結合，恢復 T 細胞對癌細胞的攻擊能力。