110 地方特考四等 食品衛生檢驗 食品分析與檢驗概要 考古題詳解

核心觀念

食品一般成分分析中的「蛋白質含量」多以「粗蛋白質（crude protein）」表示，通常不是直接測定完整蛋白質分子，而是先測定食品中的總氮量，再乘以適當的蛋白質換算係數。

基本關係式為：

$$\text{粗蛋白質含量（\%）} = \text{總氮含量（\%）}\times F$$

其中 $F$ 為蛋白質換算係數。最常用的通用係數為 $6.25$，其假設蛋白質平均含氮量為 $16\%$。

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一、凱氏氮定量法（Kjeldahl method）

凱氏法是食品分析中最經典、最常用的蛋白質測定方法。其本質是測定樣品中的有機氮，再將氮含量換算為粗蛋白質含量。

1. 測定原理

凱氏法包括消化、蒸餾及滴定三個主要階段。

（1）消化

將食品樣品與濃硫酸及催化劑加熱，使蛋白質及其他有機含氮物分解，碳、氫被氧化，氮轉變成銨鹽，通常形成硫酸銨：

$$\text{有機氮} \xrightarrow[\text{加熱}]{\text{濃硫酸、催化劑}} \text{NH}_4^+$$

消化完成後，溶液通常呈澄清狀，表示有機物已大致分解。

（2）鹼化與蒸餾

消化液冷卻後加入強鹼，例如氫氧化鈉，使銨離子轉變為氨氣：

$$\text{NH}_4^+ + \text{OH}^- \rightarrow \text{NH}_3\uparrow + \text{H}_2\text{O}$$

利用蒸氣蒸餾將氨氣帶出，並以硼酸溶液或已知濃度的標準酸吸收。

以硼酸吸收時，氨會使吸收液鹼化，之後再以標準酸滴定。

（3）滴定

以標準鹽酸或硫酸滴定所吸收的氨。酸的消耗量與樣品中氮的量成正比，因此可計算總氮含量。

若使用一價酸，例如鹽酸，其反應可表示為：

$$\text{NH}_3+\text{HCl}\rightarrow\text{NH}_4\text{Cl}$$

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2. 氮含量計算

若酸滴定體積以 mL 表示、酸濃度為 $C$ mol/L、樣品重量為 $m$ g，則：

$$\text{氮含量（\%）} = \frac{(V-V_0)\times C\times 14.007\times 100} {m\times 1000}$$

其中：

• $V$：樣品滴定所消耗的酸體積（mL）
• $V_0$：空白試驗所消耗的酸體積（mL）
• $C$：標準酸濃度（mol/L）
• $14.007$：氮的原子量
• $m$：樣品重量（g）

若使用硫酸等價數不同的酸，應依酸的當量濃度及反應當量修正計算式。

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3. 凱氏法的優點與限制

優點：

• 方法成熟，重現性良好。
• 適用於多數食品。
• 可測定低至中等含量的氮。
• 儀器設備及分析原理容易標準化。

限制：

• 測得的是氮，不是蛋白質本身。
• 非蛋白態氮，例如游離胺基酸、尿素、胺鹽及其他含氮物，也可能被計入。
• 傳統凱氏法對硝酸鹽、亞硝酸鹽中的氮通常無法完全測得，除非採用特別的還原或改良步驟。
• 消化需使用濃硫酸並加熱，操作時間較長，且具有腐蝕性。

因此，凱氏法所得結果嚴格而言是「粗蛋白質」，而非純蛋白質含量。

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二、杜馬斯燃燒法（Dumas combustion method）

杜馬斯法又稱燃燒法或總氮燃燒分析法，是另一種常用的總氮測定方法。

1. 測定原理

樣品在高溫及氧氣中完全燃燒，使有機氮轉變為氮氧化物，再經還原處理轉換成氮氣：

$$\text{有機氮} \xrightarrow{\text{高溫燃燒}} \text{NO}_x \xrightarrow{\text{還原}} \text{N}_2$$

最後以熱導度檢測器或其他適當檢測器測定氮氣量，再換算成總氮含量及粗蛋白質含量。

2. 特性

優點：

• 分析速度快。
• 不需使用濃硫酸消化。
• 自動化程度高。
• 適合大量樣品分析。

限制：

核心觀念

本題考查液相層析中兩種偵測器的基本原理、適用範圍與限制：

• 折射率偵測器（refractive index detector, RI）：量測樣品與流動相之間折射率的差異。
• 蒸發光散射偵測器（evaporative light scattering detector, ELSD）：將流出液霧化、蒸發流動相，再量測非揮發性分析物微粒對光的散射強度。

兩者皆屬於較廣用性的偵測器，適合分析缺乏紫外吸收基團的物質；但偵測訊號的形成方式、靈敏度、對流動相的要求及是否適合梯度沖提，均有明顯差異。

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一、折射率偵測器（RI）的檢測原理

1. 折射率的定義

光在介質中的速度會因介質不同而改變，折射率定義為：

$$n=\frac{c}{v}$$

其中：

• $n$ 為介質折射率；
• $c$ 為光在真空中的速度；
• $v$ 為光在該介質中的速度。

溶液的折射率會受到溶質種類與濃度影響，因此樣品通過偵測槽後，會使流動相的折射率產生變化。

2. 偵測方式

RI 通常設有兩個光學流通槽：

• 參考槽：通入純流動相；
• 樣品槽：通入經過管柱分離後的流出液。

當樣品未流出時，兩槽中的液體組成相同，折射率相近，光路維持平衡。當分析物隨流動相進入樣品槽後，樣品槽與參考槽之間產生折射率差異，使光線發生偏折，造成光束位置或光強度改變。儀器將此光學變化轉換為電訊號，形成層析峰。

其訊號本質上與樣品溶液和參考流動相之間的折射率差異有關：

$$S_{\mathrm{RI}}\propto \Delta n$$

在一定濃度範圍內，折射率差異通常與分析物濃度相關，因此可用於定性與定量分析。

3. RI 的特性

RI 屬於近似通用型偵測器，許多具有足夠折射率差異的化合物均可被偵測，例如：

• 糖類；
• 醇類；
• 有機酸；
• 脂質及部分高分子物質。

但其靈敏度通常低於紫外光偵測器，且容易受到下列因素影響：

• 溫度變化；
• 流動相組成改變；
• 流速不穩定；
• 氣泡；
• 流動相脈動。

因此 RI 偵測器通常要求偵測槽與流動相維持恆溫，並使用充分脫氣的流動相。

4. RI 不適合梯度沖提的原因

梯度沖提會使流動相組成隨時間改變，即使沒有分析物流出，流動相本身的折射率也會改變，導致基線漂移：

$$\Delta n_{\text{observed}} = \Delta n_{\text{analyte}} + \Delta n_{\text{mobile phase}}$$

此時分析物造成的訊號會與流動相組成變化所造成的訊號重疊，基線難以穩定。因此 RI 最適合搭配等度沖提（isocratic elution）。

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二、蒸發光散射偵測器（ELSD）的檢測原理

ELSD 的訊號不是直接量測溶液折射率，而是量測分析物微粒對光的散射。

1. 霧化

管柱流出液先進入霧化器，利用氣體將液體打散成許多細小液滴：

$$\text{流出液} \longrightarrow \text{細小液滴}$$

常用氮氣作為霧化氣體，以形成均勻的氣溶膠。

2. 蒸發流動相

霧化後的液滴進入加熱蒸發管。流動相中的揮發性溶劑被蒸發及移除，非揮發性分析物則濃縮形成固體微粒或非揮發性殘留物：

$$\text{含分析物液滴} \longrightarrow \text{蒸發溶劑} + \text{分析物微粒}$$

例如糖類、脂質及許多非揮發性有機物，在溶劑蒸發後會留下可散射光線的微粒。

3. 光散射偵測

以光源照射殘留微粒，微粒會使光線產生散射。光電偵測器量測散射光強度，並將其轉換為層析訊號：

$$S_{\mathrm{ELSD}}\propto I_{\mathrm{scattering}}$$

散射光強度通常受到下列因素影響：

• 分析物濃度；
• 微粒數目；
• 微粒大小；
• 微粒形狀；
• 分析物的物理性質；
• 霧化與蒸發條件。

因此 ELSD 的訊號與濃度不一定呈現完全線性關係，實務上常以對數形式描述：

$$\log S=a+b\log C$$

其中 $S$ 為偵測訊號，$C$ 為分析物濃度，$a$、$b$ 為由校正曲線取得的常數。

4. ELSD 的適用對象與限制

ELSD 適合分析：

• 糖類；
• 脂肪酸與脂質；
• 三酸甘油酯；
• 胺基酸；
• 界面活性劑；
• 缺乏紫外吸收基團的非揮發性化合物。

分析物必須具有足夠的非揮發性，且其揮發性通常要低於流動相。若分析物在蒸發過程中一同揮發，便無法形成足夠微粒，偵測訊號會很弱。

核心觀念

本題考查以 Folin-Ciocalteu（F-C）試劑測定植物萃取物「總多酚含量」的分析原理、標準曲線定量及結果換算。

F-C 法本質上是氧化還原反應：

• 植物多酚中的酚羥基具有還原性。
• F-C 試劑含有磷鉬酸、磷鎢酸等雜多酸。
• 在鹼性條件下，多酚將試劑中的 $Mo^{6+}$、$W^{6+}$ 還原成低價態。
• 反應形成藍色鉬鎢錯合物，顏色深淺與樣品中可反應物質的量大致成正比。
• 以分光光度計測定約 $760\sim765\ \text{nm}$ 的吸光度，再與標準曲線比較，即可求得總多酚含量。

須注意，F-C 法並非只對多酚具有專一反應性；維生素 C、還原糖、胺基酸、亞硫酸鹽等還原性物質也可能還原 F-C 試劑。因此嚴格而言，測得的是「F-C 試劑可反應物質所表現的總酚當量」。

解題方法

一、樣品前處理

將植物樣品以適當溶劑萃取，例如水、甲醇、乙醇或其混合液，經過濾或離心後取得萃取液。若樣品顏色過深、濃度過高，須先稀釋，使吸光度落在標準曲線的線性範圍內。

實際分析時應記錄：

• 萃取樣品重量 $m$；
• 最終萃取液體積 $V$；
• 測定前稀釋倍數 $DF$；
• 樣品測定所得吸光度。

二、配製沒食子酸標準液

通常以沒食子酸（gallic acid）作為標準品，配製數個已知濃度的標準溶液，分別與樣品使用相同的反應條件處理。

測定各標準液在指定波長的吸光度，扣除試劑空白後，建立：

$$A=aC+b$$

其中：

• $A$：扣除空白後的吸光度；
• $C$：沒食子酸濃度；
• $a$：標準曲線斜率；
• $b$：截距。

標準曲線須具有良好的線性，且樣品吸光度應落在線性範圍內。

三、F-C 顯色反應

一般操作流程如下：

1. 取適量標準液或樣品萃取液。
2. 加入 F-C 試劑並混合均勻。
3. 經過規定反應時間後，加入碳酸鈉溶液，使反應液呈鹼性。
4. 避光反應一段固定時間，使藍色充分發展。
5. 以分光光度計測定約 $765\ \text{nm}$ 的吸光度。

不同實驗室的 F-C 試劑濃度、碳酸鈉濃度、反應時間及測定波長可能略有差異，正式測定時須使標準品與樣品完全採用同一套操作條件。

四、由標準曲線求樣品濃度

將樣品吸光度代入標準曲線：

$$C_{\text{sample}}=\frac{A_{\text{sample}}-b}{a}$$

若測得的 $C_{\text{sample}}$ 是稀釋後待測液中的沒食子酸當量濃度，則原萃取液濃度為：

$$C_{\text{extract}}=C_{\text{sample}}\times DF$$

五、換算總多酚含量

若：

• $C_{\text{sample}}$ 單位為 $\text{mg/mL}$；
• $V$ 為萃取液總體積，單位為 $\text{mL}$；
• $DF$ 為稀釋倍數；

核心觀念

本題考查食品中農藥多重殘留分析的前處理技術，重點包括：

1. QuEChERS 的名稱、原理與流程
2. QuEChERS 與固相萃取（SPE）的共同點
3. 兩者在操作方式、耗材、選擇性、純化程度與適用情境上的差異

QuEChERS 是目前食品農藥多重殘留分析常用的樣品前處理方法，特別適合搭配液相層析串聯質譜儀（LC-MS/MS）及氣相層析串聯質譜儀（GC-MS/MS）。

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一、QuEChERS 的定義

QuEChERS 為下列英文詞語的字首縮寫：

• Quick：快速
• Easy：簡易
• Cheap：低成本
• Effective：有效
• Rugged：耐用、穩健
• Safe：安全

因此，QuEChERS 可譯為一種「快速、簡易、低成本、有效、穩健且安全」的農藥殘留分析前處理方法。

其基本精神是：

以有機溶劑進行萃取，利用鹽析作用促進有機相與水相分離，再以分散式固相萃取（dispersive SPE, d-SPE）進行淨化。

QuEChERS 並非單一固定配方，而是可依食品基質、待測農藥特性及儀器分析需求，調整萃取溶劑、鹽類及淨化吸附劑。

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二、QuEChERS 的基本操作流程

1. 檢體均質化

將蔬果、穀類、肉品或其他食品檢體充分均質，使農藥殘留分布較均勻，降低取樣誤差。

高含水食品通常可直接取定量檢體；低含水食品則常需先加水，使樣品中的水分狀態適合後續萃取。

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2. 以乙腈萃取

將均質檢體加入乙腈（acetonitrile）及適當內標準品，經振盪或均質混合，使農藥由食品基質轉移至乙腈中。

乙腈常被採用的原因包括：

• 可萃取相當廣泛極性的農藥
• 與水混合後容易藉由鹽析分層
• 脂肪、蛋白質及部分基質成分進入乙腈相的程度相對較低
• 適合後續 LC-MS/MS 及 GC-MS/MS 分析

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3. 加入鹽類進行鹽析分離

萃取液中加入無水硫酸鎂、氯化鈉及其他緩衝鹽類，經振盪混合後離心。

其作用包括：

• 無水硫酸鎂吸收水分
• 氯化鈉及緩衝鹽降低農藥在水相中的溶解度
• 促進乙腈與水相分離
• 使農藥較集中於乙腈層

常見的 QuEChERS 配方有原始方法、乙酸鹽緩衝系統及檸檬酸鹽緩衝系統。實際配方依官方方法及檢體基質而定。

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4. 取乙腈上清液進行分散式固相萃取淨化

將一定量的乙腈上清液加入含有吸附劑及無水硫酸鎂的離心管中，劇烈振盪後離心，取其上清液供儀器分析。

常見吸附劑及功能如下：

吸附劑	主要去除成分
PSA（primary secondary amine）	有機酸、脂肪酸、部分糖類及極性干擾物
C18	脂質、非極性干擾物
GCB（graphitized carbon black）	色素，尤其葉綠素
無水硫酸鎂	殘留水分

d-SPE 的重點是將吸附劑直接分散在萃取液中，而非將萃取液通過固定填充床。

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5. 濃縮、過濾與儀器分析

經淨化後的萃取液可依方法需求進行稀釋、濃縮及濾膜過濾，最後分別以：

• LC-MS/MS：適合較具極性、熱不穩定或不易揮發的農藥
• GC-MS/MS：適合具揮發性、熱穩定性較佳的農藥

進行定性及定量分析。

農藥濃度通常依檢量線、內標準品或基質匹配檢量線計算，並須配合空白試驗、添加回收試驗及品質控制。

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三、QuEChERS 與一般固相萃取的共同點

1. 都是樣品前處理技術

兩者均用於：

• 將待測物自複雜食品基質中分離
• 去除會干擾儀器分析的基質成分
• 提升待測物的選擇性及檢測可靠性
• 降低基質效應及儀器污染

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2. 都利用吸附劑與待測物、基質成分之間的差異

兩者均可依待測物及基質特性選用不同吸附劑，例如：

• PSA
• C18
• GCB
• 矽膠
• 氧化鋁
• 離子交換樹脂
• 聚合物型吸附劑

其分離依據包括極性、疏水性、離子交換、氫鍵作用及其他分子間作用力。

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3. 都需要控制回收率與再現性

無論採用 QuEChERS 或 SPE，均須注意：

• 待測物是否完全萃取
• 淨化過程是否造成待測物損失
• 吸附劑是否過度保留待測物
• 基質效應是否影響定量
• 方法的準確度、精密度、回收率及定量極限

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四、QuEChERS 與一般 SPE 的差異

1. 操作方式不同

一般 SPE：

樣品溶液依序通過填充於管柱或匣中的固相吸附劑，通常包括：

1. 活化
2. 平衡
3. 上樣
4. 清洗
5. 洗脫
6. 濃縮

QuEChERS：

核心觀念

油脂過氧化價（peroxide value, POV）是指每公斤油脂中，初期氧化產物過氧化物所具有的「毫當量活性氧」數，單位為：

$$\text{meq O}_2/\text{kg oil}$$

油脂氧化初期主要形成脂質氫過氧化物：

$$\mathrm{ROOH}$$

其中 $\mathrm{R}$ 代表油脂脂肪酸的不飽和烴基。POV愈高，表示油脂初期氧化程度愈嚴重。

本題核心是「碘滴定法」的氧化還原關係：

$$\text{油脂過氧化物} \longrightarrow \text{氧化碘離子，釋放碘}$$

再以硫代硫酸鈉標準液滴定所生成的碘，藉由硫代硫酸鈉消耗量計算油脂過氧化價。

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解題方法與測定原理

取一定重量的油脂試樣，溶於醋酸－氯仿混合溶劑中，加入碘化鉀。油脂中的過氧化物在酸性環境下氧化碘離子，生成碘：

$$\mathrm{ROOH+2I^-+2H^+\rightarrow ROH+I_2+H_2O}$$

生成的碘量與油脂中過氧化物的量成正比。再以已標定濃度的硫代硫酸鈉溶液滴定：

$$\mathrm{I_2+2S_2O_3^{2-}\rightarrow 2I^-+S_4O_6^{2-}}$$

滴定接近終點時加入澱粉指示劑，溶液會呈藍色；繼續滴定至藍色完全消失，即為終點。

測定時須進行空白試驗，以扣除試劑本身或操作過程所消耗的硫代硫酸鈉：

$$V_{\text{有效}}=V_{\text{試樣}}-V_{\text{空白}}$$

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滴定反應式

過氧化物氧化碘離子

以油脂氫過氧化物 $\mathrm{ROOH}$ 表示：

$$\mathrm{ROOH+2I^-+2H^+\rightarrow ROH+I_2+H_2O}$$

碘被硫代硫酸鈉還原

$$\mathrm{I_2+2S_2O_3^{2-}\rightarrow 2I^-+S_4O_6^{2-}}$$

若使用硫代硫酸鈉溶液 $\mathrm{Na_2S_2O_3}$，其離子反應式可寫成：

$$\mathrm{I_2+2Na_2S_2O_3\rightarrow 2NaI+Na_2S_4O_6}$$

實際計算以硫代硫酸根 $\mathrm{S_2O_3^{2-}}$ 的標準濃度為準。

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POV計算方式

設：

• $V$：試樣滴定所消耗的硫代硫酸鈉體積，單位 mL
• $V_0$：空白試驗所消耗的硫代硫酸鈉體積，單位 mL
• $N$：硫代硫酸鈉溶液的當量濃度，單位 eq/L
• $m$：油脂試樣重量，單位 g

則過氧化價為：

$$\boxed{ \mathrm{POV}= \frac{(V-V_0)N\times1000}{m} }$$

單位為：

$$\mathrm{meq\ O_2/kg\ oil}$$

使用莫耳濃度表示時

若題目給的是硫代硫酸鈉莫耳濃度 $C$，由反應式可知：

$$1\ \mathrm{mol\ I_2}$$

需消耗：

$$2\ \mathrm{mol\ S_2O_3^{2-}}$$