110 地方特考四等 食品衛生檢驗 食品微生物學概要 考古題詳解

核心觀念

本題考查兩部分：

1. 細菌、黴菌與酵母菌細胞壁的化學組成
2. 革蘭氏染色法（Gram stain）的操作步驟與呈色原理

其中細菌屬於原核生物；黴菌與酵母菌則屬於真菌，三者細胞壁的主要成分不同，不能混為一談。

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一、細胞壁的主要成分

（一）細菌細胞壁

細菌細胞壁的主要成分是肽聚糖（peptidoglycan，又稱 murein），由下列兩種胺基糖交替排列而成：

• $N$-乙醯葡萄糖胺（$N$-acetylglucosamine, NAG）
• $N$-乙醯胞壁酸（$N$-acetylmuramic acid, NAM）

NAG 與 NAM 形成多醣鏈，再由短肽交聯，構成具有強度的網狀結構。肽聚糖可維持細菌形狀，並抵抗滲透壓所造成的細胞破裂。

1. 革蘭氏陽性菌

革蘭氏陽性菌的特徵為：

• 肽聚糖層厚，約占細胞壁主要部分
• 含有磷壁酸（teichoic acid）
• 可分為壁磷壁酸與脂磷壁酸
• 沒有外膜

厚厚的肽聚糖層是革蘭氏陽性菌在脫色後仍能保留結晶紫－碘複合物的主要原因。

2. 革蘭氏陰性菌

革蘭氏陰性菌的細胞包膜包括：

• 內膜
• 較薄的肽聚糖層
• 外膜
• 周質空間（periplasmic space）

其外膜含有：

• 脂多醣（lipopolysaccharide, LPS）
• 磷脂
• 外膜蛋白

脂多醣可分為：

• 脂質 A（lipid A）：具有內毒素作用
• 核心多醣
• O 抗原

革蘭氏陰性菌的肽聚糖層雖較薄，但具有外膜，因此在革蘭氏染色脫色步驟中，酒精或丙酮會溶解外膜脂質，使結晶紫－碘複合物逸出，最後呈現復染劑的顏色。

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（二）黴菌細胞壁

黴菌屬於真菌，其細胞壁主要由下列物質構成：

• 幾丁質（chitin）
• 葡聚糖（glucan），尤其是 β-葡聚糖
• 甘露聚醣或甘露蛋白（mannan、mannoprotein）
• 其他細胞壁蛋白與少量脂質

其中：

• 幾丁質提供機械強度
• β-葡聚糖形成重要的支架結構
• 甘露蛋白位於細胞壁外層，與細胞表面抗原性及黏附性有關

幾丁質是由 $N$-乙醯葡萄糖胺聚合而成，與昆蟲外骨骼中的幾丁質性質相近，但真菌細胞壁並非由肽聚糖構成。

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（三）酵母菌細胞壁

酵母菌同樣屬於真菌，細胞壁主要含有：

• β-葡聚糖
• 甘露蛋白
• 幾丁質

一般而言，酵母菌細胞壁以葡聚糖與甘露蛋白為主要成分，幾丁質含量通常少於許多絲狀黴菌，但在出芽部位及隔膜處較為重要。

酵母菌細胞壁的結構可概括為：

• 內層：以 β-葡聚糖為主，提供骨架
• 外層：以甘露蛋白為主，與細胞表面特性及抗原性有關
• 局部區域：含幾丁質，尤其集中於芽痕、出芽頸部等位置

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二、細菌與真菌細胞壁比較

生物類群	細胞壁主要成分	重要特徵
革蘭氏陽性菌	厚肽聚糖、磷壁酸	無外膜，革蘭氏染色呈紫色
革蘭氏陰性菌	薄肽聚糖、外膜、脂多醣	有外膜，革蘭氏染色呈紅色或粉紅色
黴菌	幾丁質、β-葡聚糖、甘露蛋白	不含細菌型肽聚糖
酵母菌	β-葡聚糖、甘露蛋白、少量幾丁質	出芽部位幾丁質較集中

應特別注意：真菌細胞壁主要是幾丁質、葡聚糖與甘露蛋白；細菌細胞壁主要是肽聚糖。

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三、革蘭氏染色法的操作步驟

革蘭氏染色通常依序使用四種試劑：

1. 初染劑：結晶紫（crystal violet）
2. 媒染劑：碘液（Gram’s iodine）
3. 脫色劑：酒精或酒精－丙酮
4. 復染劑：番紅（safranin）或鹼性褐（basic fuchsin）

核心觀念

本題考查兩項食品微生物學的重要觀念：

1. 真空包裝並不等於無菌或絕對安全

• 真空包裝主要是降低包裝內氧氣含量，抑制需氧性微生物及氧化反應。
• 真空環境仍適合部分厭氧性或兼性厭氧性微生物生長，因此不能取代殺菌、冷藏及其他保藏措施。
• 需注意低酸性食品在缺氧環境中，可能發生肉毒桿菌增殖及肉毒毒素形成。

2. 欄柵技術（hurdle technology）

• 指同時使用兩種以上的保藏因子，形成多重「障礙」，共同抑制微生物的生長、代謝、產毒及存活。
• 各項保藏因子可產生加成或協同效果，使食品在維持品質的前提下達到安全保存目的。

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解題方法

本題可分成兩部分作答：

一、先判斷真空包裝是否絕對安全

判斷重點是分析「真空造成的低氧環境」對不同微生物的影響：

• 需氧性微生物因缺乏氧氣，生長受到抑制。
• 兼性厭氧性微生物仍能在缺氧環境下生長。
• 專性厭氧性微生物反而可能因缺氧而獲得較有利的環境。
• 真空包裝無法去除食品中原有的微生物，也不能破壞已存在的孢子或毒素。

因此，真空包裝只能說是「降低部分微生物的生長機會」，不能推論為「絕對安全」。

二、再說明欄柵技術的概念與例子

作答時應先寫出定義，再列出常見欄柵因子，最後舉出具有多重保藏效果的食品實例。

常見欄柵因子包括：

• 降低溫度：冷藏或冷凍
• 降低水活性（$a_w$）：加鹽、加糖、乾燥
• 降低酸鹼值（pH）：醋酸化、乳酸發酵
• 加熱處理：巴氏殺菌、商業殺菌
• 添加防腐劑：亞硝酸鹽、山梨酸、苯甲酸等
• 降低氧氣：真空包裝、充氮包裝
• 發酵產生有機酸、酒精或其他抑菌物質
• 控制保存時間與包裝衛生

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真空包裝是否絕對安全

結論

真空包裝不是絕對安全。

其主要作用是抽除包裝內空氣，降低氧氣濃度，因而可以：

• 抑制需氧性腐敗菌，例如部分假單胞菌；
• 延緩食品氧化酸敗；
• 減少好氧性黴菌生長；
• 延長部分食品的保存期限。

但是，真空包裝並不能達到滅菌效果，食品中原有的微生物仍可能存在。

真空環境下仍可能生長的微生物

1. 厭氧性微生物

肉毒桿菌（Clostridium botulinum）屬於重要的厭氧性產毒菌。在低酸性食品中，若同時具備下列條件，便可能增殖並產生肉毒毒素：

• 缺乏氧氣；
• pH 偏高，尤其是低酸性食品；
• 水活性足夠；
• 保存溫度及時間適合；
• 食品受到污染且未經適當殺菌。

肉毒毒素通常不會造成明顯異味、變色或腐敗外觀，因此不能以「看起來正常」判斷食品安全。

2. 兼性厭氧性微生物

兼性厭氧菌在有氧及缺氧環境中都能生長，例如：

• 乳酸菌；
• 腸桿菌科部分細菌；
• 金黃色葡萄球菌；
• 李斯特菌。

其中，李斯特菌具有耐冷性，部分菌株可在冷藏條件下生長，因此真空包裝食品即使置於冷藏環境，也不能完全排除其危害。

3. 耐冷性腐敗菌

真空包裝常會抑制部分需氧性腐敗菌，造成微生物相改變，使乳酸菌等較能適應低氧、低溫環境的微生物成為優勢菌。食品可能出現酸味、黏液、產氣或異常風味。

真空包裝安全性所受的其他因素

食品是否安全，不能只看包裝形式，還須綜合考慮：

• 食品的 pH；
• 水活性 $a_w$；
• 鹽分及糖分濃度；
• 保存溫度；
• 保存時間；
• 初始菌數；
• 原料與加工環境衛生；
• 是否經過適當加熱；
• 包裝是否完整、是否發生膨包或漏氣。

核心觀念

本題比較兩種乳品熱處理法，重點在於：

1. 熱處理的溫度與時間不同。
2. 對病原菌、營養細胞、孢子及酵素的破壞程度不同。
3. 對牛奶保存期限、風味、營養與物理化學性質的影響不同。
4. 巴斯德殺菌法不是滅菌；超高溫瞬間殺菌則以達到「商業無菌」及常溫保存為主要目的。

熱處理效果可由微生物的耐熱性理解。一般而言，營養細胞比芽孢脆弱，革蘭氏陰性菌通常比革蘭氏陽性菌耐熱性低，而細菌芽孢具有很高的耐熱性。因此，同一熱處理條件下，病原性營養細胞容易被殺死，但芽孢未必完全消失。

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解題方法

作答時可依「處理條件 → 微生物效果 → 牛奶品質 → 保存條件」的順序比較。

一、巴斯德殺菌法

巴斯德殺菌法是以低於沸點的溫度加熱牛奶，使主要病原微生物及多數營養細胞失去活性，同時盡量減少對牛奶品質的影響。

常見條件包括：

• 低溫長時間法（LTLT）：約 $63^\circ\mathrm{C}$、$30$ 分鐘。
• 高溫短時間法（HTST）：約 $72^\circ\mathrm{C}$、$15$ 秒。

實際條件必須依食品衛生相關規範及乳品種類而定；上述數值為食品微生物學中最常用的代表條件。

其基本目的，是使熱敏感性病原菌達到足夠的死亡程度。若以熱死亡動力學表示，微生物數量可近似依下式下降：

$$\log N_t=\log N_0-\frac{t}{D_T}$$

其中：

• $N_0$：加熱前微生物數量；
• $N_t$：加熱 $t$ 時間後的存活數量；
• $D_T$：在溫度 $T$ 下，使微生物數量降低 $1$ log，即降低 $90\%$ 所需的時間。

巴斯德殺菌法主要破壞的是營養細胞，不以完全消除芽孢為目標。

二、超高溫瞬間殺菌

超高溫瞬間殺菌（UHT）是將牛奶加熱至約 $135\sim150^\circ\mathrm{C}$，維持數秒，常見概念條件為約 $135^\circ\mathrm{C}$ 以上、$1\sim5$ 秒，之後迅速冷卻，並在無菌條件下充填包裝。

UHT 的目的不是單純延長冷藏期限，而是使產品在未開封狀態下達到商業無菌。所謂商業無菌，並非絕對沒有任何微生物，而是在正常保存及運輸條件下，不含能繁殖並造成腐敗或危害的微生物。

UHT 對微生物的殺滅力遠高於巴斯德殺菌法，能破壞幾乎所有營養細胞、乳酸菌、腸內菌及多數病原菌，也能大幅降低酵母菌與黴菌的存活率。細菌芽孢的耐熱性較高，仍是 UHT 設計時的重要對象；在適當溫度、時間及無菌包裝配合下，可使產品達到商業無菌狀態。

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對微生物的影響比較

比較項目	巴斯德殺菌法	超高溫瞬間殺菌
主要處理條件	約 $63^\circ\mathrm{C}$、$30$ 分鐘，或 $72^\circ\mathrm{C}$、$15$ 秒	約 $135\sim150^\circ\mathrm{C}$、數秒
主要目的	消除主要病原菌、降低菌數	使產品達商業無菌、可常溫保存
營養細胞	多數病原性及腐敗性營養細胞被殺死	幾乎全部被殺死
芽孢	通常無法完全破壞	大幅降低，但耐熱芽孢仍是關鍵風險
酵母與黴菌	多數被抑制，部分耐熱菌可能存活	幾乎完全被破壞
耐熱菌	部分乳酸菌、微球菌、芽孢菌可能存活	存活機率顯著降低
加熱後污染	需冷藏以抑制殘存菌繁殖	需無菌包裝，否則仍會再污染
保存期限	冷藏下較短	未開封常溫下較長

巴斯德殺菌後仍可能存在耐熱性較高的非病原菌、芽孢及少量殘存微生物。因此，產品必須迅速冷卻並持續冷藏。若冷藏失當，殘存菌仍可繁殖，造成酸敗、凝固、產氣或異味。

核心觀念

本題考查微生物代謝物依「產生時期、是否直接支持細胞生長，以及生理功能」所作的分類，主要分為：

1. 初級代謝物（primary metabolites）
2. 次級代謝物（secondary metabolites）

微生物生長曲線可分為遲滯期、對數生長期、靜止期與死亡期。初級代謝物主要在細胞大量生長的營養生長期產生；次級代謝物則多在細胞生長速率降低或進入靜止期後產生。

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解題方法

回答時可依下列順序：

1. 先寫出初級代謝物與次級代謝物的定義。
2. 說明兩者主要產生於生長曲線的何種階段。
3. 各舉出食品微生物或工業微生物的代表性例子。
4. 說明這些代謝物對細胞生長、能量取得或生態競爭所扮演的角色。
5. 最後補充：兩者的界線並非絕對，會受到菌種、培養基與環境條件影響。

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一、初級代謝物

1. 定義

初級代謝物是微生物在正常生長與繁殖過程中所產生，且通常直接參與細胞生長、能量取得、細胞構造合成或氧化還原平衡的代謝產物。

這類代謝物通常具有下列特徵：

• 多在對數生長期大量產生。
• 產量與細胞生長速率密切相關，故又稱為生長相關代謝物。
• 對細胞的生長與繁殖具有直接或間接的必要性。
• 通常是多數菌株都會產生的基本代謝產物。

2. 代表性例子與作用

（1）乳酸

乳酸菌將葡萄糖經乳酸發酵產生乳酸：

$$\text{Glucose} \rightarrow 2\text{Lactic acid} + \text{ATP}$$

乳酸的作用包括：

• 再生氧化型 $NAD^+$，使糖解作用得以持續。
• 產生 ATP，供細胞生長及維持生命活動。
• 降低食品的 pH 值，抑制許多腐敗菌及病原菌。
• 形成乳酸發酵食品的酸味與風味，例如優格、泡菜及酸菜。

乳酸本身是細胞能量代謝的產物，但在食品中也具有防腐與品質形成的作用。

（2）乙醇與二氧化碳

酵母進行酒精發酵時產生乙醇與二氧化碳：

$$\text{Glucose} \rightarrow 2\text{Ethanol} + 2CO_2 + 2\text{ATP}$$

其作用為：

• 使酵母在缺氧條件下維持糖解作用。
• 透過乙醇發酵再生 $NAD^+$。
• 二氧化碳使麵糰膨發，並形成啤酒、氣泡酒等產品的氣體。
• 乙醇則是酒類的主要成分，也可抑制部分微生物生長。

（3）有機酸

除乳酸外，微生物也可產生醋酸、檸檬酸、琥珀酸及其他有機酸。例如醋酸菌將乙醇氧化為醋酸：

$$\text{Ethanol} + O_2 \rightarrow \text{Acetic acid} + H_2O$$

有機酸可作為：

• 能量代謝或中間代謝產物。
• 細胞合成胺基酸、脂質及其他物質的前驅物。
• 食品酸味與風味的來源。
• 降低 pH、延長食品保存期限的抑菌因子。

（4）胺基酸、核苷酸及維生素

微生物合成的胺基酸、核苷酸及部分維生素，主要用於：

• 合成蛋白質。
• 合成 DNA 與 RNA。
• 形成輔酶或參與酵素反應。
• 建構細胞膜、細胞壁及其他細胞成分。

因此，初級代謝物不只是細胞排出的廢物，也可能是細胞內部合成與生長所必需的中間產物。

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二、次級代謝物

1. 定義

次級代謝物是微生物在基本生長需求已大致滿足後，所產生的非細胞立即生長所必需之代謝產物。其主要功能通常與生態適應、菌種競爭、防禦、訊息傳遞或環境占據有關。

這類代謝物通常具有下列特徵：

• 多在晚期對數生長期至靜止期形成。
• 與細胞生長速率的直接關聯較低，故又稱為非生長相關代謝物。
• 常具有菌種或菌株特異性。
• 產生量容易受到培養基組成、碳氮比、pH、溫度及氧氣等條件影響。
• 對產生菌的立即生長未必是必要物質，但能增加其生存與競爭能力。

2. 代表性例子與作用

（1）抗生素

例如：

• 青黴菌產生青黴素（penicillin）。
• 鏈黴菌產生鏈黴素（streptomycin）。
• 部分放線菌產生四環黴素等抗生素。

核心觀念

本題主要考查三項內容：

1. 乳酸菌食品中常稱的「ABC 菌」及其代表菌種。
2. 同型乳酸醱酵與異型乳酸醱酵的代謝途徑、產物及能量生成。
3. 乳酸菌在食品加工、保存及食品品質上的功能。

乳酸菌通常指能將醣類代謝產生大量乳酸，並具有耐酸性的一群細菌。食品中常見於乳製品、蔬菜醱酵品、肉品醱酵品及酸麵糰。

解題方法

作答時可依「名詞定義 → 代謝比較 → 食品應用」三段說明：

• 先界定 ABC 菌的三個代表菌群。
• 再以葡萄糖代謝產物、主要代謝途徑、ATP 產量及是否產生二氧化碳，區分兩類乳酸醱酵。
• 最後從酸化保存、風味形成、質地改善、益生作用及可能的腐敗影響，說明乳酸菌在食品中的角色。

一、乳酸菌之 ABC 菌

食品及營養學上所稱的乳酸菌 ABC 菌，通常包括：

A：嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）

現代分類多稱為 Lactobacillus acidophilus，為耐酸性較強的乳酸菌，常見於優格、酸乳及益生菌製品。

主要特性如下：

• 可在酸性環境中生長。
• 能產生乳酸，降低食品及腸道環境的 pH。
• 常被應用於益生菌食品。
• 有助於抑制部分腐敗菌及病原菌生長。

B：雙歧桿菌（Bifidobacterium spp.）

雙歧桿菌屬於嚴格或偏好厭氧的菌群，常見菌種包括 Bifidobacterium bifidum 及 Bifidobacterium longum。

主要特性如下：

• 常存在於人體腸道。
• 可利用醣類產生乳酸及醋酸。
• 具有益生菌應用價值。
• 對氧氣較敏感，因此食品製程及包裝需注意其存活率。

嚴格分類上，雙歧桿菌不屬於典型乳酸菌，但在食品及保健食品領域，常與嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌合稱 ABC 益生菌。

C：乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）

現代分類常稱為 Lacticaseibacillus casei，傳統食品微生物學仍普遍使用 Lactobacillus casei。

主要特性如下：

• 常應用於乳酸飲料、優格及發酵乳製品。
• 可產生乳酸以降低 pH。
• 具有一定耐酸及耐膽鹽能力。
• 常被作為益生菌及乳製品發酵菌使用。

因此，ABC 菌可簡記為：

$$A=\textit{Acidophilus},\qquad B=\textit{Bifidobacterium},\qquad C=\textit{Casei}$$

二、同型乳酸醱酵

定義

同型乳酸醱酵是指乳酸菌將葡萄糖代謝後，主要產物幾乎都是乳酸，僅產生少量副產物。

其總反應可表示為：

$$\text{Glucose} \rightarrow 2\text{ Lactate}+2\text{ ATP}$$

代謝途徑

同型乳酸醱酵主要採用糖解作用，即 Embden-Meyerhof-Parnas pathway，簡稱 EMP 途徑。

其主要步驟為：

1. 葡萄糖先被磷酸化。
2. 六碳糖裂解成兩個三碳化合物。
3. 三碳化合物經氧化及底物階段磷酸化。
4. 最後形成丙酮酸。
5. 丙酮酸再被還原成乳酸，以再生 NAD⁺，維持糖解作用進行。

丙酮酸還原反應為：

$$\text{Pyruvate}+NADH+H^+ \rightarrow \text{Lactate}+NAD^+$$

特徵

• 主要產物為乳酸。
• 每 1 分子葡萄糖淨產生 2 分子 ATP。
• 通常不產生二氧化碳。
• 酸化速度較快，適合用於乳品及部分蔬菜發酵。
• 乳酸產量高，能迅速降低食品 pH。

常見菌種

常見同型乳酸菌包括：

• Lactococcus lactis
• Streptococcus thermophilus
• Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
• 部分 Lactobacillus 及 Pediococcus 菌種

三、異型乳酸醱酵

定義

異型乳酸醱酵是指乳酸菌代謝葡萄糖時，除乳酸外，還會產生乙醇或醋酸、二氧化碳等多種產物。

典型反應可表示為：

$$\text{Glucose} \rightarrow \text{Lactate}+\text{Ethanol}+CO_2+1\text{ ATP}$$

在部分條件下，乙醇可被醋酸取代：

$$\text{Glucose} \rightarrow \text{Lactate}+\text{Acetate}+CO_2+2\text{ ATP}$$

代謝途徑

異型乳酸醱酵主要經由磷酸戊糖途徑及磷酸酮解酶途徑，關鍵酵素為 phosphoketolase。

葡萄糖經代謝後形成五碳磷酸化合物，再分解為：

• 甘油醛-3-磷酸，最後形成乳酸。
• 乙醯磷酸，最後形成乙醇或醋酸。
• 二氧化碳。

特徵