112 高普考高考三級 化學安全 環境微生物學 考古題詳解

核心觀念

本題考查以分光光度計測定液態培養中細菌濁度的原理，以及與鏡檢法、稀釋塗盤法的差異。$OD_{600}$ 和 $OD_{590}$ 分別表示在波長 $600\ \mathrm{nm}$ 與 $590\ \mathrm{nm}$ 下測得的光學密度（optical density），常用來快速追蹤細菌培養物的濁度變化。

細菌懸浮液中的細胞會散射、吸收入射光，使透射光強度降低。分光光度計以空白培養基校正背景後，量測透射光強度，並換算光學密度：

$$A=-\log_{10}\left(\frac{I}{I_0}\right) =\log_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right)$$

其中 $I_0$ 是入射光強度，$I$ 是穿過樣品後的透射光強度。細胞數量增加時，通常濁度增加、透射光減少，因此 OD 上升。在一定範圍內，OD 可用來估計培養液中的總細胞量；但它是濁度的間接指標，不是細胞數或活菌數的直接讀值。

解題方法

回答時先說明「為何選特定波長」，再交代「OD 如何反映細菌量」，最後比較三種方法的測量對象、速度與限制。

$600\ \mathrm{nm}$ 與 $590\ \mathrm{nm}$ 位於可見光紅橙光區，常用於觀察細菌懸浮液的濁度。這些波長一般不會被培養基主要成分大量吸收，且可降低部分培養基顏色或細胞色素吸收對測量的影響；實際適用波長仍須配合菌種、培養基及儀器設定。選定固定波長並以相同條件測量，可比較同一培養系統在不同時間的濁度變化。

細胞懸浮液不是理想的均勻吸收溶液，細胞造成的光散射會影響讀值。因此 OD 與細胞濃度的關係通常只在特定儀器、光徑、菌種與濃度範圍內近似線性，不能將 OD 值直接當成細胞數。若要換算成細胞數或乾重，須以該菌種和培養條件建立校正曲線；樣品過濃時，應稀釋至儀器的線性範圍再測。

與其他方法的比較

方法	主要測量結果	優點	限制
OD 測定	懸浮液濁度，近似反映總細胞量	快速、操作簡單、樣品通常可保留，適合連續追蹤生長曲線	不區分活菌與死菌，也不直接計數；受細胞大小、形態、聚集、培養基背景、氣泡及儀器光徑影響；高濃度時偏離線性

核心觀念

厭氧呼吸也會透過電子傳遞鏈與氧化磷酸化產生 ATP。它和好氧呼吸的共同點，是電子經膜上的電子傳遞系統傳遞，建立跨膜質子動力勢，再由 ATP 合成酶合成 ATP；主要差異在於末端電子受體不同。

須區分三種產生 ATP 的方式：

• 氧化磷酸化：電子傳遞鏈建立質子動力勢，驅動 ATP 合成酶產生 ATP。
• 受質層次磷酸化：代謝中間物直接把磷酸基轉移給 ADP，形成 ATP；不依賴電子傳遞鏈。
• 發酵：不使用外部末端電子受體，也不以電子傳遞鏈進行呼吸；ATP 主要由受質層次磷酸化產生。

解題方法

判斷厭氧呼吸是否有類似作用，先看它有沒有電子傳遞鏈，以及電子最後交給誰。若有膜上的電子傳遞鏈，且末端電子受體不是氧，即屬厭氧呼吸，仍可藉氧化磷酸化合成 ATP。

好氧呼吸以氧作為末端電子受體：

$$\mathrm{O_2 + 4e^- + 4H^+ \rightarrow 2H_2O}$$

厭氧呼吸則使用氧以外的末端電子受體，常見者包括硝酸根、亞硝酸根、硫酸根、延胡索酸或二氧化碳；實際可利用的受體依微生物種類而異。這些電子受體接受電子後，所進行的還原反應各不相同。

好氧與厭氧呼吸的差異

核心觀念

本題評量環境微生物學中微生物對氧氣的生理需求與代謝適應機制。微生物對分子氧（$\text{O}_2$）的利用與耐受性，取決於兩大核心要素：

1. 生物能量學與電子傳遞鏈（Bioenergetics & ETC）：是否以 $\text{O}_2$ 作為電子傳遞鏈的最終電子受體（Terminal Electron Acceptor）進行好氧呼吸以產生大量 ATP。
2. 抗氧化防禦酵素系統（Antioxidant Enzyme Systems）：在有氧環境中，代謝副產物會形成具細胞毒性的活性氧物質（Reactive Oxygen Species, ROS），如超氧陰離子（$\text{O}_2^{\bullet-}$）與過氧化氫（$\text{H}_2\text{O}_2$）。微生物是否具備消除 ROS 的酵素，決定了其在有氧條件下的存活能力：

• 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）： $2\text{O}_2^{\bullet-} + 2\text{H}^+ \xrightarrow{\text{SOD}} \text{H}_2\text{O}_2 + \text{O}_2$
• 過氧化氫酶（Catalase）： $2\text{H}_2\text{O}_2 \xrightarrow{\text{Catalase}} 2\text{H}_2\text{O} + \text{O}_2$
• 過氧化物酶（Peroxidase）： $\text{H}_2\text{O}_2 + \text{NADH} + \text{H}^+ \xrightarrow{\text{Peroxidase}} 2\text{H}_2\text{O} + \text{NAD}^+$

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解題方法

此題為典型申論題型，閱卷評分標準注重「定義精確度」與「機制對比性」。解題切入點應針對題幹要求的 4 種生長條件，各依下列四大維度進行結構化答題：

1. 氧氣需求與生長特性：定義其對 $\text{O}_2$ 濃度之依賴或耐受極限。
2. 能量代謝途徑：說明其主要進行好氧呼吸、厭氧呼吸或發酵作用。
3. 抗氧化酵素系統：明確標註 SOD 與 Catalase 的存在與否。
4. 液態還原培養基分佈與代表菌種：以流體硫乙醇酸鹽培養基（Fluid Thioglycollate Medium, FTM）的生長分層位置作為具體表徵，並舉出代表菌株佐證。

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申論內容詳解（生長條件剖析）

一、Obligate Aerobe（絕對好氧菌／專性好氧菌）

1. 定義與生長特性：必須在具有分子氧（大氣濃度約 $21\%\ \text{O}_2$）的環境下才能生長繁殖；完全缺乏 $\text{O}_2$ 時細胞會因能量衰竭而停止代謝並死亡。
2. 代謝機制：專性進行好氧呼吸（Aerobic Respiration），以 $\text{O}_2$ 為電子傳遞鏈之最終電子受體，藉由氧化磷酸化產生大量 ATP。
3. 防禦酵素：具備完整的 SOD 與 Catalase（或 Peroxidase），能快速中和 ROS，免受氧化壓力傷害。
4. 培養表徵與代表菌：在 FTM 試管中僅生長於最上層與空氣接觸之高溶氧區。常見菌種如綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）。

二、Obligate Anaerobe（絕對厭氧菌／專性厭氧菌）

1. 定義與生長特性：只能在完全無氧環境中生長；分子氧對其具有高度細胞毒性，短暫暴露於大氣即可致死。
2. 代謝機制：僅能進行發酵作用（Fermentation）或以非氧物質（如 $\text{SO}_4^{2-}$、$\text{NO}_3^-$、$\text{CO}_2$）作為最終電子受體的厭氧呼吸（Anaerobic Respiration）。
3. 防禦酵素：缺乏 SOD 與 Catalase（或含量極微），無法清除代謝過程中衍生的致命自由基；細胞內富含的敏感性金屬酵素（如含鐵硫中心的酵素）極易被分子氧直接氧化而失活。
4. 培養表徵與代表菌：在 FTM 試管中僅生長於完全無氧的試管底層。常見菌種如肉毒桿菌（Clostridium botulinum）、破傷風梭菌（Clostridium tetani）、產甲烷古菌（Methanobacterium spp.）。

三、Facultative Anaerobe（兼性厭氧菌）

1. 定義與生長特性：在有氧或無氧環境下均能生長。然而在有氧環境下的生長速率與菌體產量明顯優於無氧環境。
2. 代謝機制：

• 有氧時：優先執行好氧呼吸，基質（如葡萄糖）完全氧化可產生最多能量（約 30～32 ATP/葡萄糖）。

核心觀念

本題測驗環境微生物學中「產甲烷作用（Methanogenesis）」的代謝途徑、生理生態學特性，以及近代微生物學對「好氧產甲烷作用（Aerobic methanogenesis）」的新發現：

1. 傳統產甲烷古菌（Methanogenic Archaea）的絕對厭氧機制：

• 關鍵酵素的氧氣敏感性：產甲烷作用末端速率決定酵素「甲基輔酶M還原酶（Methyl-coenzyme M reductase, MCR）」活性中心含有低價態過渡金屬輔因子（鎳四吡咯輔因子 $\text{F}_{430}$，活性態為 $\text{Ni(I)}$）。分子氧（$\text{O}_2$）會使活性中心的 $\text{Ni(I)}$ 被氧化為無催化活性的 $\text{Ni(II)}$，造成酵素不可逆失活。此外，途徑中的一氧化碳脫氫酶／乙醯輔酶A合成酶（CODH/ACS）與多種含鐵硫簇（$[4\text{Fe}-4\text{S}]$）之還原酶亦極易被氧氣破壞。
• 熱力學與氧化還原電位需求：產甲烷代謝的電子傳遞鏈要求極低的環境氧化還原電位（通常需 $E_h < -330\text{ mV}$）。好氧環境中電位遠高於此（溶氧電位約 $+815\text{ mV}$），電子將優先流向氧氣，使產甲烷電子傳遞與能量偶聯無法進行。
• 活性氧（ROS）防禦機制匱乏：多數專性厭氧古菌缺乏足以抗衡持續性好氧逆境的過氧化氫酶（Catalase）與超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD），氧氣還原產生的超氧自由基與過氧化氫會造成致命的細胞氧化損傷。

2. 非傳統的好氧產甲烷微生物：

• 打破傳統「甲烷僅源於厭氧古菌」的教條，環境微生物學已證實存在可在「含氧環境（Oxic conditions）」下產生甲烷的微生物，解釋了自然水體表層的「好氧甲烷悖論（Oxic Methane Paradox）」。主要機制包括藍菌（Cyanobacteria）的光合驅動產甲烷反應，以及異營細菌利用碳－磷裂解酶（C-P lyase）降解甲基膦酸（Methylphosphonate, MPn）獲取磷並釋放甲烷。

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解題方法

本題屬申論題型，作答切入點採「雙層結構開展」：

1. 第一部分：剖析傳統甲烷菌絕對厭氧的成因：

• 區分「酵素化學結構層次」（MCR 與 $\text{F}_{430}$ 的氧毒性失活）、「生物能學與氧化還原電位層次」（$E_h$ 與電子受體競爭）及「抗氧化防禦系統層次」（缺乏健全 ROS 清除系統），建立具邏輯層次的論述。

2. 第二部分：回答並舉證好氧產甲烷微生物：

• 明確回答「是（有）」。
• 分別舉出具體代表性類群：
• 產氧光合微生物：藍菌（Cyanobacteria），例如微囊藻屬（Microcystis）、聚球藻屬（Synechococcus）。
• 好氧異營細菌：廣泛分布於表層水體的海洋與淡水細菌，例如浮游細菌 SAR11 進化枝（Pelagibacter ubique）及假單胞菌屬（Pseudomonas spp.），並具體寫出「甲基膦酸（MPn）分解途徑」。

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選項分析

本題為高考三級申論問答題，無單選選項。評分計分切入點與要件剖析如下：

• 子題一：為何常見甲烷菌都是絕對厭氧菌？（評分權重約 50%～60%）
• 滿分要件：必須點出「MCR 酵素活性中心之低價鎳 $\text{Ni(I)}$ 遇氧不可逆氧化」、「代謝途徑要求極低氧化還原電位（$E_h < -330\text{ mV}$）」及「缺乏足量抗活性氧防禦酵素（SOD、Catalase）」。若僅泛泛回答「因為氧氣對它有毒」而未指明酵素與化學基團名稱，僅能得基礎分數。
• 子題二：是否有可以在好氧下產生甲烷的微生物？（評分權重約 40%～50%）
• 滿分要件：必須給予肯定答案（是），並至少列出「藍菌門微生物（Cyanobacteria）」或「利用 C-P 裂解酶降解甲基膦酸的好氧細菌（如 SAR11 進化枝 Pelagibacter ubique）」，同時簡述其生理基質與轉化反應。若誤答為「好氧甲烷氧化菌（Methanotrophs，其功能為消耗甲烷而非生成甲烷）」，該子題將不予給分。

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解題技巧

1. 精準術語命中判分點：

• 關鍵酵素與金屬輔因子：甲基輔酶M還原酶（Methyl-coenzyme M reductase, MCR）、輔因子 $\text{F}_{430}$（Cofactor $\text{F}_{430}$）、$\text{Ni(I)}$ 氧化。
• 關鍵環境現象與基質：好氧甲烷悖論（Oxic Methane Paradox）、甲基膦酸（Methylphosphonate, MPn）、C-P 裂解酶（C-P lyase）、藍菌（Cyanobacteria）。

2. 避開常見概念陷阱：