110 地方特考四等 環境檢驗 環境微生物學概要 考古題詳解

核心觀念

本題考查環境微生物學的基礎實驗技術、微生物分類命名、生殖方式及氧氣需求。作答時應掌握各名詞的「定義、原理、主要用途及限制」，並以微生物學專有名詞作答。

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(一) 簡單染色法（simple staining）

核心觀念

簡單染色法是使用單一種染料將微生物細胞染色，以觀察細胞的基本形態、大小與排列方式。

常用染料包括：

• 亞甲藍（methylene blue）
• 結晶紫（crystal violet）
• 鹼性品紅（basic fuchsin）

這些染料多屬於鹼性染料，帶正電的發色基團可與帶負電的細胞表面結合，使細胞呈現明顯顏色。

解題方法

標準操作流程如下：

1. 製作微生物薄抹片。
2. 進行空氣乾燥。
3. 以火焰固定，使細胞附著於玻片上。
4. 覆蓋單一染料染色。
5. 以水沖洗去除多餘染料。
6. 吸乾後，以顯微鏡觀察。

簡單染色法主要用於初步判斷：

• 細胞形狀：球菌、桿菌、弧菌、螺旋菌等。
• 細胞排列：成對、鏈狀、葡萄狀等。
• 細胞相對大小與基本形態。

解題技巧與常見陷阱

• 「簡單」是指只使用一種染料，不是指操作不需固定或不需沖洗。
• 它不是革蘭氏染色，因此不能區分革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。
• 染色過厚、固定過度會使細胞變形，影響形態判讀。
• 簡單染色主要觀察外形，不能直接判斷細菌的生理特性或是否具有莢膜、芽孢。

【答案】

簡單染色法係以單一染料將微生物細胞染色，藉以觀察細胞之形狀、大小及排列情形。其通常先製作抹片、乾燥及熱固定，再以鹼性染料染色、沖洗及顯微鏡觀察。此法只能提供微生物的基本形態資料，無法如革蘭氏染色般進行細胞壁分類。

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(二) 血球計數法（standard medical hemacytometer）

核心觀念

血球計數法是利用具有精確刻度與固定深度的計數玻片，直接計算液體中細胞或微生物數量的方法。標準醫用血球計數器常指 Neubauer hemocytometer。

計數室具有下列特徵：

• 大方格面積為 $1\ \text{mm}^2$。
• 計數室深度為 $0.1\ \text{mm}$。
• 單一大方格體積為：

$$1\ \text{mm}^2 \times 0.1\ \text{mm} =0.1\ \text{mm}^3 =10^{-4}\ \text{mL}$$

解題方法

將適當稀釋的菌液填入計數室，在顯微鏡下計數格線內的細胞數。計算原液細胞濃度時，基本公式為：

$$\text{細胞數/mL} = \frac{\text{計數細胞總數}} {\text{計數格總體積（mL）}} \times \text{稀釋倍數}$$

若計數一個大方格，且該格內有 $N$ 個細胞，則：

$$\text{細胞數/mL} = N \times 10^{4}\times \text{稀釋倍數}$$

若計數 $n$ 個相同大方格，平均每格細胞數為 $\bar{N}$，則：

$$\text{細胞數/mL} = \bar{N}\times 10^{4}\times \text{稀釋倍數}$$

計數時通常採用「上邊線及左邊線計入，下邊線及右邊線不計入」的規則，以避免同一細胞被重複計算。

方法限制

血球計數法計算的是總細胞數，死菌與活菌均可能被計入。因此，它與平板培養法所得的菌落形成單位（CFU/mL）不同。

此外，細胞必須分散均勻；若菌液有群聚、沉降或混合不充分，計數結果會產生偏差。

解題技巧與常見陷阱

• $0.1\ \text{mm}^3=10^{-4}\ \text{mL}$ 是本法最重要的換算。
• 忘記乘以稀釋倍數，會低估原液濃度。
• 細胞集中在格線上時，必須依固定邊界規則計數。
• 血球計數法測得的是直接顯微計數值，不等於活菌數。
• 具鞭毛的微生物可能在計數過程中移動，應迅速完成觀察，並保持樣品均勻。

【答案】

血球計數法係將待測菌液置於具有精確格線及固定深度之血球計數器內，直接於顯微鏡下計算細胞數的方法。標準計數室深度為 $0.1\ \text{mm}$，一個 $1\ \text{mm}^2$ 大方格之體積為 $10^{-4}\ \text{mL}$，因此：

$$\text{細胞數/mL} = \text{每格平均細胞數} \times 10^{4} \times \text{稀釋倍數}$$

本法可測得總細胞數，但通常不能區分活細胞與死細胞。

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(三) 二名法（binomial system of nomenclature）

核心觀念

二名法是以兩個拉丁化名稱表示生物學物種名稱的命名制度，由林奈（Carolus Linnaeus）建立。兩個名稱分別為：

1. 屬名（genus）
2. 種小名（specific epithet）

例如大腸桿菌的學名為：

核心觀念

本題考查「微生物的生理、代謝與生態特性，如何轉化為環境工程上的污染物去除功能」。答題應將微生物特性與實際處理效果逐一連結，不能只羅列「繁殖快、種類多」等抽象敘述。

環境工程常利用微生物作為生物處理單元中的主要作用者，使污染物經由分解、氧化還原、同化、轉化及固定等反應，轉變為較穩定、低毒或容易分離的物質。

例如：

• 有機物經異營微生物分解為二氧化碳、水及新生細胞。
• 氨氮經硝化菌氧化為硝酸鹽，再由脫硝菌還原為氮氣。
• 磷由聚磷菌過量吸收後，藉污泥排放移除。
• 有機污泥經厭氧微生物分解產生甲烷，可回收能源。
• 土壤及地下水中的污染物可透過微生物降解、共代謝或氧化還原而降低濃度及毒性。

解題方法

本題宜採「微生物特性—作用機制—工程應用」三段式作答。先說明微生物為何適合作為處理工具，再以污水處理及其他環境工程程序舉例，最後補充其工程上的優點與操作條件。

一、種類繁多，具有高度代謝多樣性

微生物包括細菌、古菌、真菌、原生動物及藻類等，所利用的碳源、能源與電子受體種類十分廣泛。因此，微生物能處理不同性質的污染物及不同氧化還原環境。

依代謝方式可分為：

• 好氧異營微生物：利用溶解氧氧化有機物。
• 缺氧微生物：利用硝酸鹽等作為電子受體。
• 厭氧微生物：在無氧環境下分解有機物，最終可產生甲烷。
• 硝化菌：將氨氮氧化為亞硝酸鹽及硝酸鹽。
• 脫硝菌：將硝酸鹽還原為氮氣。
• 聚磷菌：在特定厭氧—好氧條件下吸收並累積大量磷。
• 硫酸鹽還原菌、鐵氧化菌及甲烷菌：分別參與硫、鐵及碳循環。

由於代謝途徑多樣，污水中的碳、氮、磷、硫及部分金屬污染物均可透過適當微生物加以轉化或去除。

二、酵素具有專一性，能有效分解特定污染物

微生物細胞內含有各種酵素，可催化水解、氧化、還原、脫鹵及芳香環裂解等反應。許多自然界中難以自行分解的有機污染物，可經微生物代謝而逐步轉化。

例如：

• 蛋白質、醣類及脂肪可先經水解，再轉化為小分子有機酸。
• 小分子有機物可進一步氧化為二氧化碳及水。
• 石油碳氫化合物可由特定微生物進行生物降解。
• 部分農藥、溶劑及芳香族化合物可經專一性酵素分解。
• 污水中的有機物可用生化需氧量 $BOD$ 及化學需氧量 $COD$ 的降低程度評估其處理效果。

好氧有機物分解可概念化表示為：

$$\text{有機物}+\mathrm{O_2} \rightarrow \mathrm{CO_2}+\mathrm{H_2O}+\text{新生細胞}$$

微生物不一定將污染物完全礦化，也可能先將污染物轉化為較易分解或毒性較低的中間產物，之後再由其他微生物接續分解。

三、繁殖迅速，具有自我增殖能力

多數細菌世代時間短，在適宜的溫度、酸鹼度、營養及溶氧條件下，能快速增加菌量。因此，生物處理系統可透過維持適當污泥濃度，使微生物持續進行污染物去除。

微生物數量可用指數生長表示：

$$X_t=X_0e^{\mu t}$$

其中，$X_0$ 為初始生物量，$X_t$ 為時間 $t$ 後的生物量，$\mu$ 為比生長速率。

此特性使活性污泥法、生物膜法及生物濾床能在有限槽體內維持大量活性微生物，提高處理效率。透過污泥回流，也能增加系統內的微生物停留時間，使生長較慢的硝化菌得以保留。

四、對環境變化具有適應及馴化能力

微生物族群具有遺傳變異及選擇作用。當系統長期接觸特定污染物時，能逐漸篩選出適合該環境的菌群，形成所謂馴化現象。

因此，生物處理系統可藉由控制進流水質、污泥齡、溶氧、氧化還原電位及污染物負荷，使有利於目標反應的微生物成為優勢族群。例如：

• 延長污泥齡，有利於硝化菌累積。
• 設置厭氧、缺氧及好氧區，可分別促進釋磷、脫硝及硝化。
• 逐步提高難分解污染物濃度，可使微生物逐漸適應。
• 以固定化細胞或生物膜方式，可提高系統對負荷變動的耐受性。

五、能在不同電子受體條件下進行氧化還原反應

環境污染物的去除，許多是氧化還原反應。微生物可依環境中可利用的電子受體，改變代謝途徑，因此能在好氧、缺氧及厭氧程序中發揮作用。

氨氮硝化可概念化表示為：

$$\mathrm{NH_4^+} \rightarrow \mathrm{NO_2^-} \rightarrow \mathrm{NO_3^-}$$

脫硝則可表示為：

核心觀念

本題要求依三種生物學特徵分類細菌：

1. 形態：依細胞外觀、長短、彎曲程度、細胞排列及特殊構造分類。
2. 對氧氣的需求：依細菌利用氧氣及耐受氧氣的能力分類。
3. 對溫度的適應性：依細菌最適生長溫度及可生長溫度範圍分類。

答題時應分成三大部分，逐類寫出「分類名稱、定義、主要特徵及代表性細菌」。

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解題方法

本題屬於環境微生物學中的「生理及形態分類題」，不涉及計算。作答順序宜採：

$$\text{形態分類} \rightarrow \text{氧氣需求分類} \rightarrow \text{溫度適應性分類}$$

各部分先列出分類，再補充判斷依據與代表例子，使答案兼具完整性與條理性。

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一、依細菌形態分類

1. 球菌（coccus，複數為 cocci）

細胞呈球形、卵圓形或近似圓形。依細胞分裂後的排列方式，還可分為：

• 雙球菌（diplococci）：兩個球菌成對排列，例如肺炎鏈球菌。
• 鏈球菌（streptococci）：球菌連成鏈狀，例如化膿性鏈球菌。
• 葡萄球菌（staphylococci）：細胞聚集成葡萄串狀，例如金黃色葡萄球菌。
• 四聯球菌（tetrads）：四個球菌排列成方形。
• 八疊球菌（sarcinae）：細胞呈立方體狀群聚。

球菌的排列方式與細胞分裂平面及分裂後細胞是否分離有關，常可作為鑑別細菌的形態依據。

2. 桿菌（bacillus，複數為 bacilli）

細胞呈桿狀，長度及粗細差異很大，可分為短桿菌、長桿菌及近似球形的球桿菌。

常見排列包括：

• 單桿菌：細胞單獨存在。
• 雙桿菌：兩個桿菌相連。
• 鏈桿菌：桿菌排列成鏈狀。

例如大腸桿菌、枯草桿菌及結核分枝桿菌均屬桿菌型。部分桿菌能形成內生孢子，例如芽孢桿菌及梭菌。

3. 彎曲或逗點狀菌（vibrio）

細胞呈弧形或逗點狀，通常只有一個彎曲，例如霍亂弧菌。

4. 螺旋菌（spirillum）

細胞呈規則而較硬的螺旋形，通常具有數個螺旋彎曲，細胞本身不易變形。

5. 螺旋體（spirochete）

細胞呈細長柔軟的螺旋形，螺旋數目較多，並具有軸絲，可在液體或黏稠環境中以彎曲、扭轉方式運動。螺旋體的細胞通常比一般螺旋菌更細、更柔軟。

6. 線絲狀或分枝狀菌

細胞延長成線絲狀，部分菌種會形成分枝構造，外觀類似真菌菌絲。例如放線菌可形成分枝菌絲及孢子構造。

7. 多形性細菌（pleomorphic bacteria）

同一菌種在不同培養條件、培養年齡或環境壓力下，可能呈現球形、桿形或不規則形等不同外觀，稱為多形性。

8. 其他特殊形態

部分細菌具有特殊外形，例如：

• 絲狀菌：細胞形成長絲。
• 柄狀菌：細胞具有柄構造。
• 星狀菌：細胞呈星狀。
• 方形或矩形菌：部分嗜鹽菌具有規則的方形外觀。

形態分類主要屬於初步分類方法，實際鑑定仍須配合染色反應、細胞壁構造、生化反應及分子生物學方法。

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二、依對氧氣的需求分類

細菌對氧氣的反應，與其能否利用呼吸作用產生能量，以及是否具有清除活性氧化物的酵素有關。氧氣代謝常涉及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）、過氧化氫酶（catalase）及過氧化物酶（peroxidase）。

1. 專性好氧菌（obligate aerobes）

必須在有氧環境下才能生長，以氧氣作為最終電子受體，主要進行好氧呼吸作用。

特徵：

• 生長集中於培養基表面或氧氣含量最高處。
• 通常具有完整的抗氧化酵素系統。
• 常見於需氧環境及表層水體、土壤。

代表例子包括枯草桿菌、假單胞菌及分枝桿菌。

2. 專性厭氧菌（obligate anaerobes）

氧氣對其具有毒性，不能在含氧環境中正常生長，主要進行厭氧呼吸或發酵作用。

特徵：

• 生長於缺氧或還原性環境。
• 缺乏足夠的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等抗氧化酵素。
• 常見於污泥、沉積物、腸道及深層土壤。

代表例子包括梭菌及部分產甲烷微生物；其中產甲烷菌屬古菌，但在環境微生物學中常與厭氧微生物一併討論。

3. 兼性厭氧菌（facultative anaerobes）

有氧時可進行好氧呼吸，無氧時則可進行厭氧呼吸或發酵，因此在有氧及缺氧環境均能生長。

特徵：

• 有氧時通常生長較旺盛，因好氧呼吸產能效率較高。
• 在培養基中常呈現整體生長，但靠近表面的部位生長較旺盛。
• 對環境氧氣變化的適應能力強。

核心觀念

本題比較三種微生物獲取能量的代謝方式，重點在於辨認：

1. 電子供應體（electron donor）：提供電子、在反應中被氧化的物質。
2. 電子接受體（electron acceptor）：接受電子、在反應中被還原的物質。
3. 最終電子接受體是否來自細胞外，以及是否具有電子傳遞鏈與氧化磷酸化。

三者的主要差異如下：

代謝方式	電子供應體	電子接受體	能量產生特徵
醱酵	有機物，如葡萄糖	同一有機基質分解後形成的有機物	不使用外部最終電子接受體，主要靠受質階段磷酸化
厭氧呼吸	有機物或無機物	外部無機電子接受體，通常不是氧氣	使用電子傳遞鏈及氧化磷酸化
好氧呼吸	有機物或無機物	氧氣 $\mathrm{O_2}$	使用電子傳遞鏈及氧化磷酸化，能量產量通常最高

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一、醱酵（fermentation）

醱酵是有機物在缺乏外部電子接受體的情況下，先被部分分解，再由分解產物接受電子的代謝方式。電子供應體與電子接受體通常都源自同一有機基質，因此不需要氧氣，也不需要硝酸鹽、硫酸鹽等外部電子接受體。

醱酵的基本流程可表示為：

$$\text{有機物} \rightarrow \text{部分氧化產物}+\mathrm{NADH}$$

接著由部分氧化產物接受 $\mathrm{NADH}$ 所攜帶的電子，使 $\mathrm{NAD^+}$ 再生：

$$\mathrm{NADH} + \text{有機電子接受體} \rightarrow \mathrm{NAD^+} + \text{還原產物}$$

例一：乳酸醱酵

乳酸菌以葡萄糖為電子供應體。葡萄糖經糖解作用形成丙酮酸，並產生 $\mathrm{NADH}$：

$$\text{葡萄糖} \rightarrow 2\text{丙酮酸} + 2\mathrm{NADH} + 2\mathrm{ATP}$$

丙酮酸再接受 $\mathrm{NADH}$ 的電子，被還原成乳酸：

$$\text{丙酮酸} + \mathrm{NADH} + \mathrm{H^+} \rightarrow \text{乳酸} + \mathrm{NAD^+}$$

因此：

• 電子供應體：葡萄糖，最終被氧化。
• 電子接受體：丙酮酸。
• 最終產物：乳酸。
• 主要能量來源：糖解作用中的受質階段磷酸化。

例二：酒精醱酵

酵母菌以葡萄糖為電子供應體。葡萄糖先形成丙酮酸，再脫羧形成乙醛；乙醛接受電子後還原成乙醇：

$$\text{丙酮酸} \rightarrow \text{乙醛} + \mathrm{CO_2}$$ $$\text{乙醛} + \mathrm{NADH} + \mathrm{H^+} \rightarrow \text{乙醇} + \mathrm{NAD^+}$$

因此：

• 電子供應體：葡萄糖。
• 電子接受體：乙醛。
• 還原產物：乙醇。
• 副產物：二氧化碳。

醱酵的關鍵不是單純「沒有氧氣」，而是「沒有使用外部最終電子接受體」。有些醱酵可在有氧環境中進行，例如酵母在高糖環境下的酒精醱酵。

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二、厭氧呼吸（anaerobic respiration）

厭氧呼吸是細胞利用電子傳遞鏈進行氧化磷酸化，但最終電子接受體不是氧氣的呼吸作用。電子接受體通常來自細胞外環境，且多為氧化態的無機物。

常見電子供應體

• 有機物：葡萄糖、乙酸、乳酸、丙酸。
• 無機物：氫氣 $\mathrm{H_2}$、硫化氫 $\mathrm{H_2S}$、亞鐵離子 $\mathrm{Fe^{2+}}$、氨 $\mathrm{NH_3}$。

常見電子接受體

• 硝酸根 $\mathrm{NO_3^-}$。
• 硫酸根 $\mathrm{SO_4^{2-}}$。
• 二氧化碳 $\mathrm{CO_2}$。
• 延胡索酸鹽（fumarate）。
• 三價鐵離子 $\mathrm{Fe^{3+}}$。

例一：硝酸鹽還原

反硝化細菌可利用有機物作為電子供應體，硝酸根作為最終電子接受體：

$$\mathrm{NO_3^-} \rightarrow \mathrm{NO_2^-} \rightarrow \mathrm{N_2}$$

以有機碳表示時，可概念化為：

$$\text{有機物} + \mathrm{NO_3^-} \rightarrow \mathrm{CO_2} + \mathrm{N_2} + \mathrm{H_2O}$$

因此：

• 電子供應體：有機物，如葡萄糖、乙酸。
• 電子接受體：硝酸根 $\mathrm{NO_3^-}$。
• 還原產物：氮氣 $\mathrm{N_2}$，也可形成亞硝酸根、氧化亞氮或一氧化氮等中間產物。

例二：硫酸鹽還原

硫酸鹽還原菌可使用乳酸、乙酸或氫氣作為電子供應體，以硫酸根作為電子接受體：

$$\mathrm{SO_4^{2-}} \rightarrow \mathrm{H_2S}$$

以氫氣為電子供應體時，可寫為：